Análisis sanitario de semillas por el método de papel de filtro, siembra en agar y detección molecular

Fundamento

En el método del papel de filtro, o blotter test, las semillas se desinfectan superficialmente cuando se busca la infección interna, o se siembran sin desinfectar cuando interesa la contaminación total, y se colocan sobre papel humedecido en cajas, que se incuban a temperatura y fotoperíodo controlados durante siete a diez días, en general con ciclos de luz ultravioleta cercana que estimulan la esporulación; después se examina cada semilla con lupa e identifican los hongos por sus estructuras de fructificación y esporas, y se informa el porcentaje de semillas infectadas por cada patógeno. El método de siembra en agar usa medios generales o selectivos y sirve para hongos que no esporulan bien en papel y para bacterias, con identificación por morfología de colonia y pruebas complementarias. El método de congelamiento se usa en soja para patógenos como Phomopsis. Para bacterias y virus, y para los patógenos cuarentenarios donde se necesita sensibilidad y rapidez, se usan métodos serológicos como ELISA e inmunofluorescencia, y moleculares como PCR en tiempo real sobre extractos de submuestras de muchas semillas, que detectan una semilla infectada entre miles. La interpretación exige distinguir los patógenos verdaderos de los saprófitos que crecen igual, y por eso el análisis lo hacen fitopatólogos entrenados. Los resultados se expresan por patógeno y se comparan con los estándares del lote o con las exigencias del país de destino.

Matriz (en qué muestra)

Semilla de soja, trigo, maíz, poroto, girasol, arroz, hortícolas y forrajeras; semilla para exportación

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cámaras de incubación con control de temperatura y de fotoperíodo con luz ultravioleta cercana; cabina de flujo laminar; lupa estereoscópica y microscopio; freezer para el método de congelamiento; termociclador de PCR en tiempo real; lector de ELISA; autoclave.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Hipoclorito para la desinfección superficial; papel de filtro; medios de cultivo generales y selectivos; kits de ELISA y de PCR para los patógenos objetivo; controles positivos.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Cajas de plástico o de Petri; pinzas; portaobjetos; bolsas de submuestreo.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Papel; medios; kits; placas.

Unidad

% · % de semillas infectadas por patógeno · presencia o ausencia en submuestras de tamaño definido · número de semillas analizadas

Rango de referencia

Estándares que van del 0 % para patógenos cuarentenarios hasta el 5 o 10 % para hongos de campo tolerados; tamaños de muestra de 400 a 1.000 semillas en los métodos de incubación y de miles en los moleculares

Norma que lo exige

Ley 20.247 de semillas y las resoluciones del INASE; las resoluciones del SENASA sobre requisitos fitosanitarios de importación y exportación y sobre plagas cuarentenarias, que exigen análisis de sanidad de los lotes; los requisitos de los países de destino en los certificados fitosanitarios; los protocolos de los semilleros para decidir el curadonorma argentina

Norma que describe la técnica

Las Reglas Internacionales para el Análisis de Semillas de la ISTA, capítulo de sanidad, con sus métodos por patógeno y especie; los métodos del International Seed Health Initiative y las fichas de la Organización Europea y Mediterránea de Protección de las Plantas; los manuales del SENASA y del INASE; los protocolos moleculares validados para cada patógenonorma argentina

Edición y vigencia de la norma

Reglas ISTA, edición 2024; métodos ISHI vigentes

Volumen de muestra

400 a 1.000 semillas para los métodos de incubación; de 3.000 a 10.000 semillas en submuestras para los métodos moleculares de patógenos cuarentenarios

Conservación y transporte

La muestra se conserva seca y fresca hasta el análisis, porque la humedad y el calor cambian la flora de la semilla en días. La decisión de desinfectar o no la superficie define lo que se mide y tiene que estar en el informe, ya que un mismo lote da resultados muy distintos según el caso. Los patógenos cuarentenarios se confirman con un segundo método y se comunican de inmediato a la autoridad. Los medios y las condiciones de incubación son parte del método y no se improvisan, porque cada patógeno tiene el suyo.

Límite de detección típico

Una semilla infectada en la muestra analizada; en los métodos moleculares por submuestras, una en varios miles

Incertidumbre típica

Las tolerancias entre repeticiones están tabuladas en las Reglas ISTA; la identificación morfológica depende del analista

Área

Agronomía; Microbiología; Biología molecular

Fecha de última actualización: 9/9/2026