Hibridación in situ fluorescente y cromogénica sobre tejido

Fundamento

Sobre el corte de tejido se aplican sondas de ácido nucleico marcadas, complementarias de la secuencia buscada. El corte se desparafina, se somete a un pretratamiento que permeabiliza y expone el ADN —calor en solución amortiguadora y digestión con proteasa, cuyo balance es lo más delicado del método—, se desnaturaliza junto con la sonda a alta temperatura y se hibrida durante horas en cámara húmeda a temperatura controlada. Los lavados de rigurosidad eliminan la sonda no unida. En la variante fluorescente la señal se ve como puntos de color en el núcleo con microscopio de fluorescencia y filtros específicos, y se cuentan las señales por núcleo en un número definido de células tumorales, calculando la relación entre la sonda del gen y la del centrómero de su cromosoma, que es el criterio de amplificación. Las sondas de rotura, con dos colores flanqueando un punto de corte, muestran la translocación como la separación de señales que normalmente están juntas. En la variante cromogénica la señal se revela con enzima y cromógeno y se observa con microscopio óptico común, lo que permite verla junto con la morfología y archivar el preparado de manera permanente. La interpretación exige contar solo núcleos tumorales enteros, no superpuestos, y seguir el criterio de conteo de la guía correspondiente.

Matriz (en qué muestra)

Cortes de tumores en parafina; citoblocks y extendidos citológicos; biopsias de médula ósea; tejido con sospecha de infección viral; material de archivo

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Sistema de hibridación con placa térmica programable y cámara húmeda; microscopio de fluorescencia con filtros y cámara; microscopio óptico para la variante cromogénica; baño termostático; estufa; escáner de preparados con análisis de imagen.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Sondas de ADN marcadas con fluoróforos o con haptenos; soluciones de pretratamiento y proteasa; soluciones de lavado de rigurosidad; contratinción nuclear; sistemas de detección cromogénica; medios de montaje antidesvanecimiento.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Portaobjetos cargados; cubreobjetos y sellador; cámaras húmedas; pipetas de precisión; controles en bloque.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Sondas y reactivos; portaobjetos; sellador; guantes.

Unidad

1 · señales por núcleo de cada sonda · relación entre gen y centrómero · número de núcleos contados y por cuántos observadores · patrón de señales de la sonda de rotura · resultado según el criterio de la guía

Rango de referencia

Los puntos de corte de amplificación y las zonas de resultado equívoco están definidos en las guías, junto con el número mínimo de núcleos a contar y la conducta ante un resultado en zona límite

Norma que lo exige

Las guías de las sociedades de patología y oncología que establecen la hibridación in situ como método de confirmación de amplificación génica y sus criterios de conteo e informe; los estándares de acreditación de laboratorios de patología; las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre productos de diagnóstico in vitro; los programas de evaluación externa específicos

Norma que describe la técnica

Las guías internacionales sobre determinación de amplificación génica por hibridación in situ, con sus criterios de conteo, relaciones de corte y manejo de casos límite; los manuales de citogenética y de patología molecular; las instrucciones de uso de las sondas comerciales

Edición y vigencia de la norma

Guías internacionales sobre hibridación in situ en patología vigentes; estándares de acreditación vigentes

Volumen de muestra

Destructivo en los cortes usados

Conservación y transporte

El pretratamiento es el punto crítico: poca digestión deja señales débiles y demasiada destruye la morfología y produce núcleos sin señal, que se leen erróneamente como deleción. Por eso cada bloque se ajusta según su fijación y se controla con un preparado de referencia. Los preparados fluorescentes se guardan a oscuras y en frío y pierden señal con el tiempo, así que se documentan con imágenes en el momento de la lectura; la variante cromogénica no tiene ese problema. Se registra el tiempo de fijación del caso, que condiciona el resultado tanto como en la inmunohistoquímica.

Límite de detección típico

Resuelve señales individuales por núcleo; detecta amplificaciones y reordenamientos presentes en una fracción de las células tumorales

Incertidumbre típica

El conteo tiene variabilidad entre observadores, sobre todo cerca de los puntos de corte; se mitiga con conteo por dos observadores y con análisis de imagen

Área

Clínico/bioquímico; Biología molecular

Fecha de última actualización: 10/9/2026