Inmunofenotipo por citometría de flujo multiparamétrica: subpoblaciones linfocitarias, leucemias y enfermedad mínima residual

Fundamento

Las células en suspensión se marcan con anticuerpos monoclonales conjugados a distintos fluorocromos, cada uno dirigido a un antígeno de superficie o intracelular, y se hacen pasar de a una por un haz láser en el citómetro de flujo: la dispersión frontal informa el tamaño, la lateral la complejidad interna, y cada detector mide la fluorescencia de un fluorocromo, con lo que se obtienen para cada célula ocho, diez o más parámetros simultáneos. El análisis se hace por sucesivas selecciones de poblaciones en gráficos bidimensionales, siguiendo estrategias estandarizadas: se identifican las poblaciones normales por su patrón de maduración y se buscan poblaciones aberrantes, que expresan combinaciones de antígenos que no existen en la hematopoyesis normal, por ejemplo un marcador de célula inmadura junto con uno de línea madura. Los paneles están consensuados por línea y por sospecha diagnóstica, con marcadores de células B, T, mieloides y de precursores. Para la enfermedad mínima residual se adquieren millones de eventos y se buscan las células con el fenotipo aberrante del diagnóstico, con sensibilidades de una célula en diez mil o en un millón, lo que exige estandarización estricta de la calibración del equipo, de los fluorocromos y del análisis. El recuento absoluto de CD4 y CD8 se hace con tubos con un número conocido de microesferas fluorescentes que sirven de referencia de volumen, o con un contador hematológico en paralelo.

Matriz (en qué muestra)

Sangre entera con EDTA o heparina; médula ósea; ganglio y otros tejidos en suspensión; líquidos de punción

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Citómetro de flujo multiparamétrico de 8 a 12 colores con dos o tres láseres, con software de adquisición y de análisis; centrífuga; agitador; cabina de seguridad biológica; contador hematológico.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Paneles de anticuerpos monoclonales conjugados; soluciones de lisis de glóbulos rojos y de permeabilización para marcadores intracelulares; microesferas de calibración y de compensación; microesferas de recuento absoluto; controles de proceso.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos de citometría; pipetas; filtros de nylon para suspensiones de tejido; tubos con EDTA y con heparina.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Anticuerpos; soluciones; microesferas; tubos.

Unidad

% · % de células positivas por marcador · células/µL de recuento absoluto · % de células con fenotipo aberrante para enfermedad mínima residual

Rango de referencia

Linfocitos T CD4 en adulto sano: 500 a 1.500 células/µL; por debajo de 200 hay riesgo de infecciones oportunistas; enfermedad mínima residual negativa por debajo de 0,01 % de células aberrantes en los protocolos de leucemia aguda

Norma que lo exige

Las guías de diagnóstico y tratamiento de leucemias y linfomas de la Sociedad Argentina de Hematología y de los protocolos cooperativos, que exigen inmunofenotipo al diagnóstico y evaluación de enfermedad mínima residual en los puntos del protocolo; las guías de la Dirección de Respuesta al VIH del Ministerio de Salud para el recuento de CD4; las obras sociales y el sistema de alto costo para autorizar tratamientos dirigidos; ISO 15189norma internacional

Norma que describe la técnica

Las guías del consorcio EuroFlow para paneles estandarizados de inmunofenotipo y para enfermedad mínima residual; las recomendaciones del International Council for Standardization in Haematology; CLSI H43 para el inmunofenotipo por citometría de flujo y H42 para el recuento de linfocitos; la clasificación de la OMS de tumores hematopoyéticos (2022); ISO 15189norma internacional

Edición y vigencia de la norma

Guías EuroFlow, actualizadas; CLSI H43-A2 (2007); clasificación OMS de tumores hematolinfoides, 5.ª edición (2022)

Volumen de muestra

3 a 5 mL de sangre con EDTA o heparina; 1 a 3 mL de médula ósea con heparina en el primer aspirado; los ganglios y tejidos se envían en medio de cultivo

Conservación y transporte

La muestra se procesa dentro de las 24 a 48 horas y no se refrigera por debajo de 4 grados ni se congela: las células mueren y los antígenos se pierden, sobre todo en muestras de médula y en líquidos. La médula se toma del primer aspirado, antes de que se diluya con sangre periférica, porque una médula hemodiluida no permite evaluar la enfermedad mínima residual. El citómetro se calibra cada día con microesferas y las compensaciones entre fluorocromos se verifican; un panel mal compensado inventa poblaciones. El informe describe la población, su fenotipo completo y su porcentaje, y se integra con la morfología, la citogenética y la biología molecular.

Límite de detección típico

0,01 % de células aberrantes con adquisición de un millón de eventos; una célula en diez mil en paneles estándar

Incertidumbre típica

±5 a 10 % relativo en porcentajes de poblaciones mayoritarias; mayor en poblaciones minoritarias por la estadística de conteo

Área

Clínico/bioquímico; Biología molecular; Microbiología

Fecha de última actualización: 9/9/2026