Calorimetría isotérmica de titulación para la caracterización de interacciones moleculares

Fundamento

El instrumento tiene dos celdas idénticas en un bloque adiabático: la de referencia, con tampón, y la de muestra, con la macromolécula en solución, y un sistema que mantiene las dos exactamente a la misma temperatura. Una jeringa motorizada inyecta en la celda de muestra pequeñas alícuotas del ligando, y cada inyección produce una unión que libera o absorbe calor; el sistema mide la potencia que hay que entregar o retirar para compensar esa diferencia térmica, y el área de cada pico es el calor de esa inyección. A medida que los sitios de unión se van ocupando, el calor por inyección disminuye hasta que solo queda el calor de dilución. La curva de calor por mol de ligando agregado contra la relación molar tiene forma sigmoidea, y su ajuste a un modelo de unión da simultáneamente la constante de afinidad, a partir de la pendiente en el punto de inflexión, la estequiometría, a partir de la posición de ese punto, y la entalpía de la interacción, a partir de la altura total; con la constante se calcula la energía libre y por diferencia la entropía. Esa separación entre entalpía y entropía es lo que distingue a la técnica: dos compuestos con la misma afinidad pueden lograrla por mecanismos distintos, uno por enlaces de hidrógeno y otro por efecto hidrofóbico, y eso guía la optimización de un candidato a fármaco. Se corre siempre un experimento de control con el ligando inyectado en tampón solo, para restar el calor de dilución.

Matriz (en qué muestra)

Proteínas y sus ligandos; anticuerpos y antígenos; ácidos nucleicos; enzimas e inhibidores; complejos de inclusión; tensioactivos

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Calorímetro isotérmico de titulación con celdas de 200 µL a 1,4 mL, jeringa de inyección motorizada, control de temperatura de milésimas de grado y software de ajuste de modelos; sistema de desgasificación; balanza analítica; espectrofotómetro para determinar concentraciones con exactitud.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Tampones de alta pureza idénticos para la celda y la jeringa; proteínas y ligandos purificados y cuantificados; soluciones de verificación del instrumento (unión de calcio a EDTA o de 2-CMP a ribonucleasa).

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Membranas de diálisis o columnas de intercambio de tampón; jeringas de llenado; viales; filtros.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Tampones; proteínas y ligandos; membranas.

Unidad

J/mol · kcal/mol y kJ/mol de entalpía · constante de afinidad en M elevado a menos 1 · constante de disociación en nM o µM · estequiometría adimensional

Rango de referencia

Constantes de disociación medibles de nanomolar a milimolar en el formato directo, y hasta picomolar por competencia; se necesitan entre 10 y 100 µg de proteína por corrida en los equipos modernos

Norma que lo exige

Los programas de desarrollo de biofármacos y de moléculas pequeñas, que exigen la caracterización biofísica de la interacción en los expedientes de investigación; las guías ICH Q6B para productos biotecnológicos en cuanto a la caracterización; los proyectos de investigación de la Agencia I+D+i y del CONICET; las publicaciones científicas, que piden los termogramas y los parámetros ajustadosnorma internacional

Norma que describe la técnica

Las recomendaciones de la comunidad de calorimetría sobre la realización y el informe de experimentos de titulación isotérmica; los ensayos de comparación interlaboratorio de ABRF sobre reproducibilidad; los manuales de los fabricantes con los sistemas de referencia de verificación; ISO/IEC 17025 para los laboratorios de servicionorma internacional

Edición y vigencia de la norma

Recomendaciones de buenas prácticas en calorimetría de titulación isotérmica (2015), vigentes

Volumen de muestra

300 µL a 2 mL de solución de macromolécula a concentración conocida con exactitud, y 100 a 300 µL de ligando a diez o veinte veces esa concentración

Conservación y transporte

La macromolécula y el ligando tienen que estar en exactamente el mismo tampón, y por eso se dializan juntos o se intercambia el tampón por columna: una diferencia mínima de pH o de sal entre la jeringa y la celda produce calores de mezcla que superan a los de la unión y arruinan el experimento. Las soluciones se desgasifican para que no se formen burbujas en la celda. Las concentraciones tienen que conocerse con exactitud, porque un error del 10 % en la concentración se traslada directo a la estequiometría y a la entalpía. Las celdas se lavan a fondo entre experimentos; un resto de proteína adherida da picos anómalos.

Límite de detección típico

Calores del orden de 0,1 µcal por inyección en los equipos de alta sensibilidad

Incertidumbre típica

±5 a 10 % en entalpía y en la constante de afinidad; dominada por la exactitud de las concentraciones

Área

Química analítica; Farmacéutico; Biología molecular

Fecha de última actualización: 9/9/2026