ADN y proteínas de la célula huésped residuales en productos biotecnológicos

Fundamento

El ADN residual se determina por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real dirigida a secuencias repetitivas del genoma de la línea celular de producción, que da la mayor sensibilidad, o por hibridación con sondas o por métodos de unión a colorantes fluorescentes cuando el nivel es más alto; la muestra se digiere con proteasas y se purifica el ADN antes de amplificar, y se corre siempre un control de inhibición porque las matrices proteicas concentradas inhiben la reacción y darían resultados falsamente bajos. El resultado se expresa en picogramos de ADN por dosis y se compara con el límite establecido. Las proteínas de la célula huésped se determinan por inmunoensayo con un antisuero policlonal generado contra el conjunto de proteínas de la línea celular cultivada en condiciones de producción sin el producto; la clave del método es la cobertura de ese antisuero, es decir qué proporción de las proteínas presentes reconoce, que se evalúa por electroforesis bidimensional con inmunodetección y es lo que la autoridad regulatoria revisa con más atención. Los métodos por espectrometría de masas de alta resolución identifican y cuantifican las proteínas residuales una por una, sin depender de anticuerpos, y se usan como método ortogonal y para investigar. La proteína A lixiviada de las columnas de afinidad y los demás reactivos de proceso —antiespumantes, inductores, antibióticos, agentes de inactivación viral— se determinan con métodos específicos.

Analito (qué se mide)

ADN residual de la célula huésped, proteínas de la célula huésped, proteína A y otros reactivos de proceso

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes; graneles purificados y producto terminado; muestras de cada etapa de purificación; productos de expresión en células de mamífero, en levaduras y en bacterias; biosimilares

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Termociclador en tiempo real; lector de microplacas; equipo de electroforesis bidimensional con inmunodetección; cromatógrafo líquido acoplado a espectrometría de masas de alta resolución; centrífuga refrigerada; campana de flujo laminar; sistema de manejo de líquidos.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Juegos de extracción y de amplificación de ADN con sondas específicas de la línea celular; patrones de ADN de la línea; juegos de inmunoensayo de proteínas de célula huésped con su antisuero; patrones de proteína A; reactivos de digestión y de espectrometría; agua libre de nucleasas.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos y placas de reacción; microplacas; puntas con filtro; geles; viales; columnas de limpieza.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Reactivos moleculares y de inmunoensayo; puntas y placas; guantes; geles.

Unidad

kg/kg · pg de ADN de célula huésped por dosis · ng de proteínas de célula huésped por mg de producto · cobertura del antisuero (%) · proteína A lixiviada (ng/mg) · reactivos de proceso residuales

Rango de referencia

Los límites de referencia se ubican en el orden de 10 ng de ADN por dosis para productos parenterales según las recomendaciones internacionales, y las proteínas de célula huésped se especifican por producto, con frecuencia por debajo de 100 ng por miligramo

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre productos biotecnológicos y sobre el contenido del expediente de registro; las guías internacionales armonizadas sobre calidad de productos biotecnológicos, que fijan los criterios de control de impurezas de proceso; las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud sobre sustratos celulares; las buenas prácticas de fabricación

Norma que describe la técnica

Las guías internacionales armonizadas sobre derivación y caracterización de sustratos celulares y sobre especificaciones de productos biotecnológicos; los capítulos de las farmacopeas de referencia sobre determinación de ADN residual y de proteínas de la célula huésped; las guías de las agencias sobre evaluación de la cobertura del antisuero; los métodos por espectrometría de masas para impurezas de proceso

Edición y vigencia de la norma

Guías internacionales armonizadas sobre productos biotecnológicos vigentes; farmacopeas de referencia en sus ediciones vigentes

Volumen de muestra

Destructivo. De 0,1 a 1 mL de producto por determinación, y muestras de todas las etapas del proceso para el estudio de eliminación

Conservación y transporte

Las muestras se guardan congeladas en alícuotas de un solo uso y se descongelan una vez, porque los ciclos degradan el ADN y agregan las proteínas, y ambas cosas mueven el resultado. El área de biología molecular se mantiene separada y descontaminada, con controles negativos en cada tanda, ya que el ADN es el contaminante más fácil de arrastrar en un laboratorio. Se corren siempre los controles de inhibición y de recuperación por agregado conocido, sin los cuales un resultado bajo no se puede interpretar. Se archivan las muestras de cada etapa del proceso, que son las que permiten demostrar la capacidad de eliminación del método de purificación.

Límite de detección típico

Del orden de 1 a 10 pg de ADN por mililitro y de 1 a 5 ng de proteínas de célula huésped por mililitro

Incertidumbre típica

Del orden del 20 al 50 % relativo, propio de los métodos de trazas en matrices proteicas complejas

Área

Farmacéutico; Biología molecular

Fecha de última actualización: 10/9/2026