Agregados solubles en biofármacos por exclusión molecular y dispersión de luz

Fundamento

La cromatografía de exclusión molecular separa por tamaño: las moléculas grandes no entran en los poros de la columna y salen primero, las chicas se demoran. El detector ultravioleta da la proporción de cada especie como porcentaje del área total. El punto delicado es la fase móvil: si la proteína interactúa con la columna, el perfil cambia, de modo que la composición del amortiguador es parte del método y se verifica con el material de referencia del producto. La dispersión de luz multiángulo acoplada en línea agrega lo que la exclusión sola no da: la masa molar absoluta de cada pico, sin depender de la calibración con patrones ni de la forma de la molécula. Los agregados grandes pueden quedarse en la columna o disgregarse al pasar por ella, y por eso los métodos ortogonales —fraccionamiento en flujo de campo, ultracentrifugación analítica— no son un lujo: son lo que demuestra que lo que el cromatograma muestra es lo que la muestra tiene.

Analito (qué se busca)

Agregados solubles

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión; proteínas recombinantes terapéuticas; formulaciones liofilizadas y líquidas; muestras de estabilidad y de estrés; graneles y producto terminado; biosimilares en desarrollo

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo líquido con columna de exclusión molecular y detectores ultravioleta y de dispersión de luz multiángulo; equipo de fraccionamiento en flujo de campo; ultracentrífuga analítica cuando corresponde.

Proveedores de Cromatografía líquida (HPLC/UPLC).

Reactivos¿Dónde lo compro?

Fases móviles; patrones de masa molar; material de referencia del producto; agua libre de partículas; filtros validados que no retengan agregados.

Proveedores de Patrones y materiales de referencia.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de exclusión; celdas de dispersión; celdas de ultracentrífuga; viales libres de partículas; jeringas y filtros validados.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Fases móviles y patrones; columnas; viales; guantes; filtros.

Unidad

kg/kg · monómero, dímero y agregados (% del área) · masa molar absoluta de cada especie (kDa) · índice de polidispersidad · partículas por mililitro por rango de tamaño · morfología de las partículas contadas

Rango de referencia

Tiene un límite máximo en la especificación; se sigue a lo largo de toda la estabilidad y después de cualquier estrés

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre productos biotecnológicos y sobre su expediente de registro; la Farmacopea Argentina en sus capítulos de partículas en inyectables y de métodos cromatográficos; las guías internacionales armonizadas sobre especificaciones y sobre estabilidad de productos biotecnológicos; las guías sobre inmunogenicidad y sobre partículas subvisibles en productos proteicosnorma argentina

Norma que describe la técnica

Los capítulos de las farmacopeas de referencia sobre cromatografía de exclusión molecular, sobre partículas subvisibles en inyectables y sobre métodos para agregados en productos proteicos; las guías internacionales armonizadas sobre pruebas de especificaciones de productos biotecnológicos; las guías de las agencias sobre caracterización de agregados y su relación con la inmunogenicidadnorma argentina

Edición y vigencia de la norma

Farmacopeas de referencia en sus ediciones vigentes; guías internacionales armonizadas sobre productos biotecnológicos vigentes

Volumen de muestra

Destructivo. De 0,5 a 5 mL de producto según las técnicas empleadas

Conservación y transporte

La muestra se manipula con cuidado extremo porque el propio manejo genera agregados: no se agita, no se hace espuma, no se pipetea con fuerza y no se congela y descongela salvo que sea parte del diseño; cada ciclo se registra. Se guarda a la temperatura declarada y se lleva a temperatura de ensayo de manera suave. El material debe estar libre de partículas y no se usan filtros salvo que estén validados para el producto, ya que retienen agregados y esconden justamente lo que se busca. Se corre un control de referencia del propio producto en cada serie para verificar que el sistema no esté generando o perdiendo agregados.

Límite de detección típico

La exclusión molecular resuelve especies desde el 0,05 % del área; el conteo de partículas detecta desde 1 a 2 µm

Incertidumbre típica

Del orden del 5 al 10 % relativo en los porcentajes de especies y del 20 al 30 % en el conteo de partículas subvisibles

Área

Farmacéutico; Biología molecular

Fecha de última actualización: 1/10/2026

Ficha N.º 3827 · ¿Ves algo para corregir? Escribinos