Agregados y variantes de tamaño en biofármacos por exclusión molecular y dispersión de luz

Fundamento

Ninguna técnica cubre todo el rango de tamaños, así que se usa una batería ortogonal. La cromatografía de exclusión molecular separa monómero, dímeros y agregados solubles pequeños por su volumen hidrodinámico y es el método de rutina, con la advertencia de que la fase estacionaria puede retener o disociar agregados y por eso se valida con controles. Acoplada a dispersión de luz multiángulo da la masa molar absoluta de cada pico sin depender de la calibración, lo que confirma la naturaleza de las especies. El fraccionamiento en flujo de campo por flujo asimétrico separa sin fase estacionaria y por eso recupera agregados grandes que la columna pierde. La ultracentrifugación analítica es el método de referencia para cuantificar agregados sin ninguna interacción con superficies, aunque es lento y requiere equipo especializado. La dispersión dinámica de luz detecta la presencia de agregados grandes y da el índice de polidispersidad, útil como tamizaje rápido. En el rango subvisible, el conteo por oscurecimiento de luz y la microscopía de imagen de flujo cuentan y clasifican partículas de uno a cien micrómetros, y esta última distingue agregados proteicos de burbujas y de silicona por su morfología, lo que es decisivo para interpretar. Las partículas visibles se inspeccionan según la farmacopea. El conjunto se interpreta junto con el estrés al que se sometió la muestra.

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión; proteínas recombinantes terapéuticas; formulaciones liofilizadas y líquidas; muestras de estabilidad y de estrés; graneles y producto terminado; biosimilares en desarrollo

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo líquido con columnas de exclusión y detectores ultravioleta, de índice de refracción y de dispersión de luz multiángulo; equipo de fraccionamiento en flujo de campo; ultracentrífuga analítica; equipo de dispersión dinámica de luz; contador de partículas por oscurecimiento de luz; microscopio de imagen de flujo; cabina de inspección visual.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Fases móviles con solución amortiguadora y sales; patrones de calibración de masa molar; agua libre de partículas; patrones de conteo de partículas; material de referencia del propio producto.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de exclusión; celdas de dispersión; celdas de ultracentrífuga; viales libres de partículas; jeringas y filtros validados.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Fases móviles y patrones; columnas; viales; guantes; filtros.

Unidad

kg/kg · monómero, dímero y agregados (% del área) · masa molar absoluta de cada especie (kDa) · índice de polidispersidad · partículas por mililitro por rango de tamaño · morfología de las partículas contadas

Rango de referencia

Las especificaciones de agregados por exclusión molecular suelen ubicarse por debajo del 1 al 5 % según el producto y su etapa de vida útil; las partículas subvisibles se comparan con los límites de la farmacopea para inyectables

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre productos biotecnológicos y sobre su expediente de registro; la Farmacopea Argentina en sus capítulos de partículas en inyectables y de métodos cromatográficos; las guías internacionales armonizadas sobre especificaciones y sobre estabilidad de productos biotecnológicos; las guías sobre inmunogenicidad y sobre partículas subvisibles en productos proteicosnorma argentina

Norma que describe la técnica

Los capítulos de las farmacopeas de referencia sobre cromatografía de exclusión molecular, sobre partículas subvisibles en inyectables y sobre métodos para agregados en productos proteicos; las guías internacionales armonizadas sobre pruebas de especificaciones de productos biotecnológicos; las guías de las agencias sobre caracterización de agregados y su relación con la inmunogenicidadnorma argentina

Edición y vigencia de la norma

Farmacopeas de referencia en sus ediciones vigentes; guías internacionales armonizadas sobre productos biotecnológicos vigentes

Volumen de muestra

Destructivo. De 0,5 a 5 mL de producto según las técnicas empleadas

Conservación y transporte

La muestra se manipula con cuidado extremo porque el propio manejo genera agregados: no se agita, no se hace espuma, no se pipetea con fuerza y no se congela y descongela salvo que sea parte del diseño; cada ciclo se registra. Se guarda a la temperatura declarada y se lleva a temperatura de ensayo de manera suave. El material debe estar libre de partículas y no se usan filtros salvo que estén validados para el producto, ya que retienen agregados y esconden justamente lo que se busca. Se corre un control de referencia del propio producto en cada serie para verificar que el sistema no esté generando o perdiendo agregados.

Límite de detección típico

La exclusión molecular resuelve especies desde el 0,05 % del área; el conteo de partículas detecta desde 1 a 2 µm

Incertidumbre típica

Del orden del 5 al 10 % relativo en los porcentajes de especies y del 20 al 30 % en el conteo de partículas subvisibles

Área

Farmacéutico; Biología molecular

Fecha de última actualización: 10/9/2026