Caracterización de biofármacos: mapa de péptidos, perfil de glicosilación y variantes por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas

Fundamento

En el mapa de péptidos, la proteína se desnaturaliza, se reduce y se alquila para abrir los puentes disulfuro, y se digiere con tripsina, que corta después de cada lisina y arginina y produce un conjunto de péptidos característico de la secuencia; los péptidos se separan por cromatografía líquida en fase reversa y se detectan por ultravioleta y por espectrometría de masas de alta resolución con fragmentación, que da la masa exacta de cada péptido y la secuencia de sus fragmentos. Comparado con el mapa de la referencia y con la secuencia teórica, confirma la identidad, cubre toda la secuencia y cuantifica en cada sitio las modificaciones: deamidación de asparagina, oxidación de metionina, glicación, variantes del extremo carboxilo y los sitios de glicosilación ocupados. El perfil de glicosilación se obtiene liberando los glicanos unidos a asparagina con la enzima PNGasa F, marcándolos con un fluoróforo y separándolos por cromatografía de interacción hidrofílica con detección de fluorescencia y espectrometría de masas, lo que cuantifica cada estructura: galactosilación, fucosilación, ácido siálico, manosas altas y las estructuras inmunogénicas. Las variantes de carga se separan por cromatografía de intercambio catiónico o por isoelectroenfoque capilar, y las variantes de tamaño (agregados y fragmentos) por cromatografía de exclusión con detección de dispersión de luz y por electroforesis capilar con dodecilsulfato de sodio. La masa intacta de la proteína y de sus subunidades por espectrometría de masas completa el conjunto. Cada método se valida y se usa para liberación, estabilidad y comparabilidad.

Analito (qué se mide)

Identidad de la secuencia, modificaciones postraduccionales, perfil de glicosilación y variantes de carga y de tamaño de proteínas terapéuticas

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales; proteínas recombinantes (insulinas, eritropoyetina, hormonas, enzimas); biosimilares; vacunas de proteínas; graneles y productos terminados biotecnológicos

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo líquido de ultra alta presión con detectores ultravioleta y de fluorescencia; espectrómetro de masas de alta resolución (cuadrupolo-tiempo de vuelo u Orbitrap) con fuente de electrospray; sistema de electroforesis capilar con detección ultravioleta y de fluorescencia inducida por láser; cromatógrafo de exclusión con detector de dispersión de luz multiángulo; termobloque y centrífuga para las digestiones; software de análisis de mapas de péptidos y de glicanos.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Tripsina de grado secuenciación y otras proteasas; ditiotreitol o TCEP y yodoacetamida; PNGasa F; reactivos de marcado de glicanos (2-aminobenzamida o etiquetas de espectrometría de masas); patrones de glicanos y de proteínas; solventes y aditivos de grado espectrometría de masas; producto de referencia.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de fase reversa, de interacción hidrofílica, de intercambio catiónico y de exclusión; capilares; viales de bajo enlace de proteínas; filtros de centrífuga.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Columnas; enzimas; patrones; solventes; capilares.

Unidad

1 · % de cobertura de secuencia · % de cada modificación en cada sitio · % de cada glicano · % de variantes ácidas, básicas, agregados y fragmentos · Da de masa intacta

Rango de referencia

Cobertura de secuencia mayor al 95 %; modificaciones habituales de 1 a 5 % por sitio; agregados menores al 1 a 2 %; los perfiles de glicanos se aceptan dentro de los rangos de la referencia

Norma que lo exige

Ley 16.463 y la Disposición ANMAT 3827/2018; las disposiciones de la ANMAT sobre el registro de medicamentos biológicos y biosimilares (Disposición 7075/2011 y sus modificatorias), que exigen la caracterización fisicoquímica completa y los estudios de comparabilidad; las guías de la OMS sobre productos bioterapéuticos similares, adoptadas por la ANMAT; las exigencias de los mercados de exportaciónargentina e internacional

Norma que describe la técnica

Guía ICH Q6B sobre especificaciones y procedimientos analíticos para productos biotecnológicos; ICH Q5E sobre comparabilidad; USP <1055> para la identificación de péptidos y proteínas por mapeo de péptidos; Farmacopea Europea 2.2.55 para el mapa de péptidos y 2.2.59 para el análisis de glicanos; USP <129> para los anticuerpos monoclonales; ICH Q2(R2) para la validación de los métodosargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B (1999), vigente; USP <1055>, USP-NF 2024

Volumen de muestra

De 0,1 a 1 mg de proteína por conjunto de análisis; los productos se envían en su envase original y refrigerados o congelados según el rótulo

Conservación y transporte

La cadena de frío del biofármaco es parte del ensayo: una muestra que se descongeló y se volvió a congelar tiene más agregados y más deamidación que el lote. Las digestiones se hacen con tiempos, temperaturas y pH controlados, porque la propia preparación de la muestra induce deamidación y oxidación artificiales, y se corren blancos y la referencia en paralelo. Los espectrómetros de masas se calibran cada día y las columnas se acondicionan con la proteína. Los resultados se comparan siempre con el producto de referencia analizado en la misma corrida.

Límite de detección típico

Modificaciones desde el 0,1 % en un sitio por espectrometría de masas; glicanos desde el 0,1 % del total

Incertidumbre típica

±5 a 10 % relativo en el porcentaje de cada modificación o glicano; ±0,5 % en variantes de carga y de tamaño

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 9/9/2026