Determinación de subunidades por espectrometría de masas de alta resolución

Fundamento

La medición de la masa de la proteína entera, sin cortarla, es la comprobación estructural más directa y más rápida que existe para un biofármaco. La proteína se desala en línea por cromatografía de fase reversa o por exclusión molecular con fase móvil volátil y entra al espectrómetro de masas por electrospray, que la ioniza sin romperla y produce una distribución de estados de carga múltiple; el procesamiento de esa distribución, llamado deconvolución, devuelve la masa de la especie neutra. En una glicoproteína, el espectro deconvolucionado no muestra un solo pico sino un peine de picos separados por las masas de los azúcares, de modo que la misma medición asigna las glicoformas principales y da su abundancia relativa. Cuando la molécula es grande y la heterogeneidad enmascara los detalles, se recurre al análisis por subunidades: la proteína se reduce para separar las cadenas pesada y liviana, o se corta con una proteasa específica de la región bisagra que la parte en fragmentos definidos, y cada subunidad se mide por separado con mucha mejor resolución; ese enfoque es el que permite localizar en qué cadena está una modificación. El mismo método, sobre la molécula sin reducir, verifica el conteo de puentes disulfuro por la diferencia de masa respecto de la forma reducida. En un conjugado anticuerpo-fármaco, la medición de masa intacta es directamente el método para determinar la relación entre fármaco y anticuerpo y su distribución. La exactitud alcanzable es de unas pocas partes por millón en péptidos y de decenas de partes por millón en proteínas enteras, suficiente para distinguir un solo aminoácido cambiado.

Analito (qué se busca)

subunidades

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión y proteínas recombinantes; conjugados anticuerpo-fármaco; biosimilares en comparabilidad; graneles y productos terminados biotecnológicos

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Espectrómetro de masas de alta resolución con fuente de electrospray, cuadrupolo-tiempo de vuelo u Orbitrap, con rango de masa extendido; cromatógrafo líquido con columna de fase reversa de poro ancho o de exclusión molecular para el desalado en línea, con horno de alta temperatura; software de deconvolución de espectros de carga múltiple y de asignación de glicoformas.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Solventes y aditivos volátiles de grado espectrometría de masas; agente reductor para el análisis de subunidades; proteasa específica de la región bisagra; patrones de calibración de masa en el rango de trabajo; producto de referencia.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de poro ancho dedicadas a proteínas intactas; viales de bajo enlace de proteínas; filtros de centrífuga para el intercambio de buffer cuando la formulación no es compatible.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Columnas; solventes de alta pureza; patrones de calibración; enzimas.

Unidad

kg · masa molecular intacta observada y teórica (Da y kDa) · desviación entre ambas (ppm o Da) · masa de las cadenas pesada y liviana y de los fragmentos de bisagra · glicoformas asignadas y su abundancia relativa (%) · diferencia de masa entre las formas reducida y no reducida como verificación de los puentes disulfuro · relación fármaco-anticuerpo y su distribución en conjugados

Rango de referencia

En una glicoproteína no hay un valor único de masa: el espectro es un peine de glicoformas, y pedir «la masa» de un anticuerpo sin decir de qué glicoforma no tiene sentido

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre registro de medicamentos biológicos y biosimilares, que exigen la determinación de la masa molecular como parte de la caracterización fisicoquímica; los protocolos de comparabilidad ante cambios de proceso; los requisitos de los mercados de exportación; las normas de acreditación del laboratorionorma internacional

Norma que describe la técnica

La guía ICH Q6B, que incluye la masa molecular entre las propiedades fisicoquímicas a determinar; ICH Q5E sobre comparabilidad; el método general de espectrometría de masas de las farmacopeas y los capítulos sobre caracterización de proteínas terapéuticas y sobre anticuerpos monoclonales; los procedimientos validados del laboratorio para la deconvolución y la asignación de glicoformasnorma internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B; ICH Q5E; capítulos de caracterización de proteínas de las farmacopeas vigentes

Volumen de muestra

De 10 a 50 µg de proteína por determinación

Conservación y transporte

La muestra se conserva según su especificación y, si la formulación tiene tensioactivos o sales no volátiles, se intercambia el buffer antes de inyectar, porque suprimen la ionización y arruinan el espectro.

Límite de detección típico

Se resuelven diferencias de masa de unos pocos daltons sobre proteínas de más de cien kilodaltons

Incertidumbre típica

De 10 a 50 ppm sobre proteínas intactas, mejor sobre subunidades

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 1/10/2026

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