Ensayo de pirógenos en conejo y ensayo de activación de monocitos (MAT)

Fundamento

En el ensayo en conejo, se mide la temperatura rectal basal de tres conejos con sondas y se les inyecta por la vena de la oreja la solución de ensayo, precalentada, a la dosis fijada por la monografía; se registra la temperatura durante tres horas y la suma de los aumentos de los tres animales se compara con los límites de la farmacopea: si supera el primer límite se amplía a más conejos, y el producto se rechaza si la suma de ocho supera el límite final. Los conejos, el equipo y el ambiente se controlan para que la temperatura no varíe por estrés. En el ensayo de activación de monocitos, el producto se incuba con sangre humana entera o con monocitos aislados o una línea celular monocítica: los pirógenos de cualquier origen activan los receptores de los monocitos, que liberan citoquinas proinflamatorias, en general interleuquina 6 o interleuquina 1 beta, o factor de necrosis tumoral. La citoquina se cuantifica por ELISA y se compara con una curva de patrón de endotoxina, con lo que se expresa el contenido pirogénico total en unidades de endotoxina equivalentes. El ensayo se valida para cada producto verificando que la matriz no interfiere y que se recupera un pirógeno agregado, tanto endotoxina como un pirógeno no endotoxínico como el ácido lipoteicoico, y para productos con baja tolerancia se hace el ensayo de comparación de referencia. Los donantes de sangre se seleccionan y se agrupan para reducir la variabilidad.

Matriz (en qué muestra)

Inyectables y soluciones parenterales de gran volumen; vacunas; productos biológicos; dispositivos médicos implantables; agua para inyectables

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Para conejos: sala de ensayo con temperatura controlada, cajas de sujeción, sondas rectales con registro continuo, baño para precalentar soluciones. Para el MAT: cabina de flujo laminar, incubadora de dióxido de carbono, lector de placas de ELISA, centrífuga, pipetas multicanal, freezer a -80 grados para las reservas de sangre criopreservada.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Patrón de referencia de endotoxina; ácido lipoteicoico u otro pirógeno no endotoxínico para la validación; kits de ELISA de interleuquina 6 o 1 beta; medio de cultivo; sangre de donantes sanos o sangre criopreservada validada, o líneas celulares monocíticas; agua apirógena; solución salina apirógena para los conejos.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Placas de 96 pocillos apirógenas; tubos y puntas apirógenas certificadas; jeringas y agujas estériles apirógenas; material despirogenado por calor seco.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Kits de ELISA; sangre o células; material apirógeno; conejos.

Unidad

K · grados de aumento de temperatura en conejos · unidades de endotoxina equivalentes por mL o por mg en el MAT

Rango de referencia

En conejos, el producto aprueba si la suma de aumentos de tres animales no supera 1,15 grados y ninguno supera 0,5 grados; en el MAT, el límite de contaminación pirogénica se fija para cada producto a partir de la dosis, como en el ensayo de endotoxinas

Norma que lo exige

Ley 16.463 y la Disposición ANMAT 3827/2018 de buenas prácticas de fabricación; la Farmacopea Argentina y las monografías que exigen el ensayo de pirógenos para determinados productos; las normas de la ANMAT para vacunas y biológicos, que remiten a la OMS; la Ley 14.346 y las normas de bienestar animal para el uso de conejos, que empujan el reemplazo por el MATargentina e internacional

Norma que describe la técnica

USP <151> para el ensayo de pirógenos en conejo y Farmacopea Europea 2.6.8; Farmacopea Europea 2.6.30 para el ensayo de activación de monocitos; USP <1085.1>; guía de la OMS y del EDQM para la implementación del MAT; ISO 10993-11 para la pirogenicidad de dispositivos médicosargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

USP <151>, USP-NF 2024; Farmacopea Europea 2.6.30, 11.ª edición

Volumen de muestra

Para conejos, volumen suficiente para la dosis por kilogramo de tres a ocho animales, más el precalentamiento; para el MAT, 1 a 5 mL del producto por ensayo, con las diluciones de validación

Conservación y transporte

Todo lo que toca la muestra tiene que ser apirógeno: el vidrio despirogenado a 250 grados y el plástico certificado; una punta de pipeta común contamina. Los productos se ensayan en su envase original y se abren dentro de la cabina. Para el MAT, la sangre de donantes se usa dentro de las horas de extraída o se recurre a sangre criopreservada validada; los donantes con infecciones o con medicación antiinflamatoria se excluyen. Los conejos se acostumbran a la sala y a las cajas antes del ensayo y no se usan más de lo que permite la farmacopea.

Límite de detección típico

0,05 a 0,1 unidades de endotoxina por mL en el MAT; el ensayo en conejo detecta del orden de 1 a 5 unidades por kg de dosis

Incertidumbre típica

±20 a 30 % relativo en el MAT por la variabilidad biológica entre donantes; el ensayo en conejo es cualitativo con criterio de aceptación

Área

Farmacéutico; Microbiología; Toxicología

Fecha de última actualización: 9/9/2026