PCR en tiempo real (qPCR)

Fundamento

La amplificación se sigue ciclo a ciclo mediante una sonda de hidrólisis o un colorante intercalante que emite fluorescencia proporcional al producto acumulado. El ciclo umbral (Ct) en que la señal supera el fondo es inversamente proporcional a la cantidad inicial de blanco.

Analito (qué se busca)

Copias de secuencia blanco

Matriz (en qué muestra)

ADN extraído

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Termociclador de tiempo real con módulo óptico; cabina de PCR; microcentrífuga.

Proveedores de Biología molecular.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Master mix con polimerasa hot-start; sondas TaqMan o colorante SYBR Green; cebadores; estándares de curva; control interno de amplificación.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Placas ópticas de 96 pocillos o tiras; films de sellado ópticos.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Puntas con filtro; placas ópticas.

Proveedores de Micropipetas y puntas.

Unidad

copias/µL · Ct · copias/mL · log10 copias

Rango de referencia

Eficiencia de amplificación aceptable: 90-110%

Norma que lo exige

ISO 15189, que fija los requisitos de calidad y competencia de los laboratorios clínicos y es el marco bajo el cual se realiza esta determinación. La norma no describe el método: cada laboratorio lo valida según el equipo y el reactivo que usa, y sigue las instrucciones de uso del fabricante.norma internacional

Edición y vigencia de la norma

Esta técnica no responde a una norma única: se aplica con procedimientos internos validados por cada laboratorio, o forma parte de un método más amplio que sí tiene norma. Si el resultado va a usarse con fines regulatorios o legales, hay que acordar de antemano el procedimiento y su validación.

Volumen de muestra

1 a 10 ng de ADN por reacción, de un extracto de 20 a 100 µL

Conservación y transporte

Tubo con el ADN en buffer TE o en agua libre de nucleasas. Refrigerar a 4 °C por días, o congelar a −20 °C. Evitar ciclos de congelado y descongelado: fragmentan el ADN.

Límite de detección típico

10 copias por reacción en un ensayo bien optimizado

Incertidumbre típica

±10 a 25% en la cuantificación absoluta; mejor en la relativa

Área

Biología molecular; Clínico/bioquímico

Fecha de última actualización: 3/9/2026

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