Péptidos por digestión enzimática y cromatografía líquida acoplada a masas

Fundamento

Un biofármaco no se describe con una fórmula química: es una proteína de decenas de miles de daltons, y la forma de demostrar que su secuencia es la correcta es cortarla en pedazos reproducibles y mirar el conjunto. La proteína se desnaturaliza, se reducen los puentes disulfuro con ditiotreitol o TCEP y los cisteínos se alquilan con yodoacetamida para que no vuelvan a cerrarse, y se digiere con tripsina de grado secuenciación, que corta específicamente después de cada lisina y de cada arginina y produce un conjunto de péptidos característico de esa secuencia y de ninguna otra. Los péptidos se separan por cromatografía líquida en fase reversa con gradiente largo y se detectan en ultravioleta y por espectrometría de masas de alta resolución, que da la masa exacta de cada uno, y por fragmentación, que da la secuencia de sus aminoácidos. El perfil se compara con el mapa teórico calculado a partir de la secuencia y con el del producto de referencia: la coincidencia de los tiempos de retención y de las masas confirma la identidad, y el porcentaje de la secuencia efectivamente observada es la cobertura, que se informa como medida de cuán completo fue el examen. El mismo mapa cuantifica las modificaciones sitio por sitio, calculando para cada una la fracción del área del péptido modificado sobre la suma del modificado y el nativo: deamidación de asparagina, oxidación de metionina, glicación, variantes del extremo carboxilo terminal, ciclación del extremo amino y ocupación de los sitios de glicosilación. Esas fracciones son las que se siguen en estabilidad y las que se comparan entre un biosimilar y su referencia. El método exige control estricto de las condiciones de digestión, porque el propio tratamiento induce deamidación y oxidación artefactuales que se confunden con las del producto.

Analito (qué se busca)

Péptidos

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes: insulinas, eritropoyetina, hormonas y enzimas; biosimilares en desarrollo y en comparabilidad; graneles y productos terminados biotecnológicos; muestras de estudios de estabilidad

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo líquido de ultra alta presión con detector ultravioleta y control fino de temperatura de columna; espectrómetro de masas de alta resolución con fuente de electrospray, cuadrupolo-tiempo de vuelo u Orbitrap, con capacidad de fragmentación; termobloque con control de temperatura para las digestiones; centrífuga refrigerada; software de identificación de péptidos y de cuantificación de modificaciones.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Tripsina de grado secuenciación y otras proteasas de especificidad complementaria; ditiotreitol o TCEP; yodoacetamida; agentes caotrópicos y buffers de digestión; solventes y aditivos de grado espectrometría de masas; patrones de calibración de masa; producto de referencia.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de fase reversa de partícula pequeña dedicadas a péptidos; viales y placas de bajo enlace de proteínas; filtros de centrífuga para el intercambio de buffer; puntas de baja retención.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Columnas; enzimas; solventes de alta pureza; viales.

Unidad

1 · % de cobertura de secuencia observada · % de deamidación, de oxidación y de glicación en cada sitio · % de variantes del extremo carboxilo y de ciclación del extremo amino · % de ocupación de los sitios de glicosilación · coincidencia de tiempos de retención y de masas con el producto de referencia · masa exacta de cada péptido (Da)

Rango de referencia

La digestión modifica la proteína mientras la analiza: si se hace a pH alto o se estira el tiempo, aparecen deamidaciones y oxidaciones que no estaban en el producto. Sin un control de digestión en paralelo, se informa como defecto del lote algo que lo produjo el método

Norma que lo exige

La ley de medicamentos y las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre el registro de medicamentos biológicos y biosimilares, que exigen la caracterización fisicoquímica completa y los estudios de comparabilidad con el producto de referencia; las especificaciones de liberación y de estabilidad aprobadas en el registro; las exigencias de los mercados de exportación; las normas de acreditación y las buenas prácticas de laboratorio de controlnorma internacional

Norma que describe la técnica

La guía ICH Q6B sobre especificaciones y procedimientos analíticos para productos biotecnológicos; ICH Q5E sobre comparabilidad ante cambios en el proceso; el capítulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos sobre identificación de péptidos y proteínas por mapeo de péptidos; el método general de la Farmacopea Europea sobre mapa de péptidos; el capítulo sobre anticuerpos monoclonales; ICH Q2 para la validación del métodonorma internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B; ICH Q5E; ICH Q2(R2); métodos generales de mapa de péptidos de las farmacopeas vigentes

Volumen de muestra

De 50 a 200 µg de proteína por digestión

Conservación y transporte

La muestra se conserva a la temperatura de su especificación y se evita congelar y descongelar repetidamente, que induce agregación. Los digeridos se analizan el mismo día o se congelan, porque la deamidación sigue avanzando en el vial del automuestreador.

Límite de detección típico

Las modificaciones se cuantifican desde alrededor del 0,1 al 0,5 % del sitio, según el péptido

Incertidumbre típica

Del 5 al 20 % relativo sobre el nivel de cada modificación, mayor en los niveles bajos

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 1/10/2026

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