Perfil de glicanos unidos a asparagina por liberación enzimática, marcado y cromatografía de interacción hidrofílica

Fundamento

La mayoría de los biofármacos son glicoproteínas: sobre determinadas asparaginas llevan cadenas de azúcares que la célula productora agrega y que no están codificadas en el gen, de modo que dependen del clon, del medio y de las condiciones de cultivo. Esas cadenas no son un detalle estructural: la fucosilación del núcleo gobierna la citotoxicidad mediada por células, la galactosilación influye en la activación del complemento, el ácido siálico afecta la vida media en circulación y las estructuras de manosa alta aceleran el aclaramiento; además, los epitopes de galactosa alfa y de ácido N-glicolilneuramínico, propios de ciertas líneas celulares, son inmunogénicos en el ser humano. El análisis se hace liberando los glicanos con la enzima PNGasa F, que corta el enlace con la asparagina y deja la cadena entera libre; los glicanos liberados se purifican y se marcan por aminación reductiva con un fluoróforo, en general 2-aminobenzamida o una etiqueta de última generación que además ioniza bien, porque los azúcares no absorben en ultravioleta ni ionizan por sí solos y sin marcar no se detectan con sensibilidad útil. La mezcla marcada se separa por cromatografía de interacción hidrofílica, que ordena las estructuras por polaridad y resuelve isómeros que otras técnicas no separan, con detección de fluorescencia para cuantificar y espectrometría de masas para asignar cada pico a una composición. El resultado es el porcentaje de área de cada estructura sobre el total, y a partir de él los índices agregados que se especifican: fucosilación, galactosilación, sialilación y manosas altas. El perfil se compara con el de la referencia dentro de rangos definidos, y su desplazamiento es la primera señal de que algo cambió en el cultivo.

Analito (qué se busca)

Glicanos unidos a asparagina

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales y glicoproteínas recombinantes; biosimilares en comparabilidad con su referencia; graneles y productos terminados; muestras de cambios de proceso y de escalado; lotes de estabilidad

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo líquido de ultra alta presión con detector de fluorescencia y columna de interacción hidrofílica termostatizada; espectrómetro de masas de alta resolución acoplado para la asignación de estructuras; termobloque para la liberación y el marcado; centrífuga; equipo de purificación de glicanos marcados en fase sólida; software de asignación y de cálculo de índices agregados.

Reactivos¿Dónde lo compro?

PNGasa F; reactivos de desnaturalización compatibles con la enzima; reactivo de marcado por aminación reductiva, 2-aminobenzamida con cianoborohidruro o etiqueta instantánea equivalente; patrones de glicanos y escalera de dextrano para el cálculo de unidades de glucosa; solventes de grado espectrometría de masas; producto de referencia.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de interacción hidrofílica dedicadas; cartuchos o placas de purificación de glicanos; viales de bajo enlace; placas de 96 pocillos para el procesamiento en paralelo.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Enzima; reactivos de marcado; columnas; cartuchos de purificación; patrones.

Unidad

1 · % de área de cada estructura sobre el total de glicanos · % de fucosilación del núcleo · % de galactosilación (G0, G1, G2) · % de sialilación · % de manosas altas · % de estructuras inmunogénicas de galactosa alfa y de ácido N-glicolilneuramínico · unidades de glucosa de cada pico según la escalera de dextrano

Rango de referencia

El perfil de glicanos es lo primero que se mueve cuando cambia algo en el cultivo: el clon, el medio, la temperatura o la densidad celular. Un desplazamiento del perfil sin cambio en la potencia igual bloquea una comparabilidad

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre registro de medicamentos biológicos y biosimilares, que exigen la caracterización de la estructura de carbohidratos y la comparabilidad con la referencia; las especificaciones de liberación aprobadas, que en muchos productos incluyen índices de glicosilación; los requisitos de los mercados de exportación; las normas de acreditación del laboratorionorma internacional

Norma que describe la técnica

La guía ICH Q6B, que fija la caracterización de la estructura de carbohidratos como parte de la caracterización fisicoquímica; ICH Q5E sobre comparabilidad; el método general de la Farmacopea Europea sobre análisis de glicanos de glicoproteínas, con la liberación, el marcado y la separación; el capítulo de la Farmacopea de los Estados Unidos sobre análisis de glicoproteínas y de glicanos; los procedimientos validados del laboratorionorma internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B; ICH Q5E; métodos generales de análisis de glicanos de las farmacopeas vigentes

Volumen de muestra

De 50 a 200 µg de glicoproteína por determinación

Conservación y transporte

La muestra se conserva según su especificación. Los glicanos marcados se protegen de la luz y se analizan dentro de los plazos validados, porque la etiqueta fluorescente se degrada y los porcentajes relativos se desplazan.

Límite de detección típico

Las estructuras minoritarias se cuantifican desde alrededor del 0,1 % del área total

Incertidumbre típica

Del 5 al 15 % relativo sobre cada estructura, mejor sobre los índices agregados

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 22/9/2026