Valoración microbiológica de antibióticos por difusión en agar (cilindro-placa) y por turbidimetría

Fundamento

En el método de difusión en agar, una capa de agar inoculada con un microorganismo de prueba sensible al antibiótico (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Kocuria rhizophila, según el antibiótico) se vierte en placas grandes o en cajas de Petri; sobre el agar se apoyan cilindros de acero o se perforan pocillos, que se llenan con diluciones del patrón de referencia y de la muestra en un diseño balanceado, en general tres dosis del patrón y tres de la muestra. Durante la incubación el antibiótico difunde radialmente e inhibe el crecimiento alrededor del cilindro; el diámetro del halo de inhibición crece con el logaritmo de la concentración. Se miden los halos con calibre o con lector de imagen, se verifica la linealidad y el paralelismo de las rectas del patrón y de la muestra, y se calcula la potencia relativa con su intervalo de confianza por análisis de varianza según el diseño de la farmacopea. En el método turbidimétrico, diluciones del patrón y de la muestra se incuban en tubos con caldo inoculado durante tres a cuatro horas, y la inhibición del crecimiento se mide como la reducción de la turbidez a 530 o 580 nm; es más rápido y sirve para antibióticos que difunden mal. La potencia se expresa en unidades internacionales o en microgramos de actividad por miligramo, respecto del patrón de referencia de la farmacopea.

Analito (qué se mide)

Potencia de antibióticos y de antimicrobianos por actividad biológica

Matriz (en qué muestra)

Principios activos antibióticos; medicamentos terminados (inyectables, comprimidos, cremas); premezclas veterinarias; materias primas

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cabina de seguridad biológica; incubadoras a la temperatura del ensayo; placas grandes de vidrio o de plástico niveladas; cilindros de acero inoxidable normalizados y dispensador; lector automático de halos o calibre digital; espectrofotómetro o lector de turbidez para tubos; autoclave; nivelador de placas.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Patrones de referencia de antibióticos de la farmacopea; medios de cultivo de la farmacopea para cada ensayo (antibiótico medio 1, 2, 3, 11 y otros); cepas de referencia de colecciones certificadas; soluciones tampón de la farmacopea; formaldehído o ácido para detener el crecimiento en turbidimetría.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Placas y tubos estériles; pipetas calibradas; matraces; asas; frascos de dilución.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Medios de cultivo; patrones; cepas; material estéril descartable.

Unidad

1 · unidades internacionales por mg o por mL · µg de actividad por mg · % de la potencia declarada

Rango de referencia

Los lotes se aceptan cuando la potencia está entre 90 y 115 % o entre 95 y 105 % de la declarada según el producto, con un intervalo de confianza del 95 % no mayor a ±5 a 10 % de la potencia

Norma que lo exige

Ley 16.463 de medicamentos y la Disposición ANMAT 3827/2018 de buenas prácticas de fabricación, que exigen el control de calidad de cada lote según la farmacopea; la Farmacopea Argentina, que fija la valoración microbiológica como método oficial para los antibióticos que lo requieren; el SENASA para los productos veterinarios y las premezclas medicamentosasargentina e internacional

Norma que describe la técnica

Farmacopea Argentina, capítulo de valoración microbiológica de antibióticos; USP <81> para la valoración de antibióticos por métodos microbiológicos; Farmacopea Europea 2.7.2; Farmacopea Británica, apéndice XIV Aargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

USP <81>, USP-NF 2024; Farmacopea Argentina, 7.ª edición

Volumen de muestra

1 a 5 g o mL de producto, o 20 unidades para formas farmacéuticas; el patrón de referencia se pesa en cantidades de decenas de miligramos

Conservación y transporte

Los patrones de referencia se conservan según su rótulo, en general refrigerados y en desecador, y se dejan atemperar cerrados antes de pesar; un patrón húmedo da potencias altas para todas las muestras. Las cepas de trabajo se mantienen con un número controlado de pases y se verifican periódicamente. Las soluciones de antibiótico se usan dentro del período de estabilidad fijado por la farmacopea, que para algunos es de horas. La temperatura y el espesor del agar tienen que ser uniformes: una placa desnivelada da halos asimétricos y arruina el diseño estadístico.

Límite de detección típico

No aplica; es un ensayo de potencia relativa

Incertidumbre típica

±5 a 10 % relativo en la potencia con el diseño de tres dosis y réplicas suficientes

Área

Farmacéutico; Microbiología; Veterinaria

Fecha de última actualización: 9/9/2026