Análisis de metilación del ADN por conversión con bisulfito y secuenciación, PCR específica de metilación y pirosecuenciación

Fundamento

La metilación no se ve en una secuenciación común porque la citosina metilada se lee igual que la no metilada. El tratamiento con bisulfito de sodio convierte las citosinas no metiladas en uracilo, que después de la amplificación se lee como timina, mientras que las citosinas metiladas resisten y siguen leyéndose como citosina: la metilación se convierte así en una diferencia de secuencia. A partir del ADN convertido, la PCR específica de metilación usa dos pares de cebadores, uno que amplifica solo la versión metilada de la región y otro solo la no metilada, y da un resultado cualitativo rápido para promotores de genes; la pirosecuenciación y la PCR en tiempo real cuantitativa dan el porcentaje de metilación en cada citosina de una región corta, con exactitud del orden del 5 %; la secuenciación masiva de amplicones o de captura cuantifica cientos de regiones, y la secuenciación de bisulfito de genoma completo, todas. Los microarreglos de metilación interrogan cientos de miles de sitios y son la base de los clasificadores de tumores cerebrales y de los relojes epigenéticos. Las técnicas enzimáticas de conversión, que no fragmentan el ADN como el bisulfito, y la secuenciación de nanoporos, que lee la metilación directamente sin conversión, se están incorporando. La eficiencia de la conversión se controla con citosinas fuera de contexto CpG, que deben convertirse todas, y con controles totalmente metilados y no metilados.

Matriz (en qué muestra)

ADN de tejido tumoral, sangre, saliva, materia fecal, líquidos biológicos y tejido vegetal o animal

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Termociclador; kits y equipo de conversión con bisulfito; pirosecuenciador o termociclador de PCR en tiempo real; secuenciador masivo; escáner de microarreglos de metilación; fluorómetro; software de análisis de metilación.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Kits de conversión con bisulfito o enzimática; cebadores diseñados para ADN convertido; controles de ADN totalmente metilado y no metilado; kits de pirosecuenciación; microarreglos de metilación.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos libres de nucleasas; placas; columnas de purificación.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Kits de conversión; cebadores; chips de microarreglos; reactivos de secuenciación.

Unidad

% · % de metilación por sitio CpG · metilado o no metilado en PCR específica · puntaje de clasificador epigenético · edad epigenética

Rango de referencia

Los promotores de genes activos tienen menos del 10 % de metilación y los silenciados, más del 60 a 80 %; el promotor de MGMT se considera metilado por encima de umbrales del orden del 10 % según el método; la eficiencia de conversión debe superar el 99 %

Norma que lo exige

Las guías de neurooncología que exigen la metilación de MGMT para el tratamiento del glioblastoma y la clasificación de tumores del sistema nervioso central de la OMS (2021), que incorpora perfiles de metilación; las obras sociales que cubren los estudios con indicación; Ley 26.689 de enfermedades poco frecuentes para los síndromes de impronta; los reactivos de diagnóstico requieren registro ante la ANMATargentina e internacional

Norma que describe la técnica

Las guías de la Asociación para la Patología Molecular sobre el análisis de metilación de MGMT; la clasificación de tumores del sistema nervioso central de la OMS (2021); las recomendaciones de la Sociedad Europea de Genética Humana para el diagnóstico de trastornos de impronta; los protocolos del proyecto ENCODE y del consorcio Blueprint para la secuenciación de bisulfito; ISO 15189argentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

Clasificación de la OMS de tumores del SNC, 5.ª edición (2021)

Volumen de muestra

200 a 500 ng de ADN para bisulfito, que degrada la mayor parte; 50 ng bastan para los métodos enzimáticos; el tejido tumoral se marca por el patólogo como en los estudios de mutaciones

Conservación y transporte

El bisulfito fragmenta y degrada más del 90 % del ADN, así que se parte de ADN suficiente y de buena calidad, y el ADN convertido se usa dentro de días o se congela en alícuotas. La metilación varía entre tipos celulares: una muestra de sangre mide la mezcla de leucocitos y un tejido con células normales infiltrantes diluye la señal del tumor, lo que hay que tener en cuenta al interpretar porcentajes. Los cebadores para ADN convertido tienen que evitar sesgar hacia la versión metilada o la no metilada, y eso se verifica con mezclas de los controles a porcentajes conocidos.

Límite de detección típico

1 a 5 % de metilación en una región por pirosecuenciación; 0,1 % por PCR específica de metilación cuantitativa

Incertidumbre típica

±5 % en valor absoluto en el porcentaje de metilación por pirosecuenciación

Área

Biología molecular; Clínico/bioquímico

Fecha de última actualización: 9/9/2026