Biopsia líquida: detección de mutaciones en ADN tumoral circulante por PCR digital y secuenciación

Fundamento

Las células tumorales que mueren liberan a la sangre fragmentos cortos de ADN, de unos 160 pares de bases, que circulan mezclados con mucho más ADN de las células normales, sobre todo de los glóbulos blancos. La sangre se toma en tubos con un estabilizador que impide que los leucocitos se rompan y diluyan la muestra con su ADN, y el plasma se separa por doble centrifugación sin arrastrar células. El ADN libre se extrae con kits para fragmentos cortos y se cuantifica; se obtienen unos pocos nanogramos por mililitro de plasma. Para buscar una mutación conocida se usa PCR digital, que reparte la muestra en decenas de miles de gotas o pocillos y cuenta cuántos tienen la variante y cuántos el alelo normal, con lo que detecta una copia mutada entre 10.000 normales; para buscar varias sin conocerlas se usan paneles de secuenciación masiva con identificadores moleculares únicos, que marcan cada molécula original para descartar los errores de secuenciación y llegar a frecuencias alélicas de 0,1 a 0,5 %. La ausencia de una variante en plasma no descarta que esté en el tumor, porque algunos tumores liberan poco ADN; por eso un negativo se informa con la cantidad de ADN analizada y puede llevar a la biopsia de tejido. Las variantes de hematopoyesis clonal, que vienen de los glóbulos blancos y no del tumor, se descartan secuenciando también la capa leucocitaria.

Analito (qué se mide)

ADN libre circulante y variantes somáticas en ADN tumoral circulante

Matriz (en qué muestra)

Plasma de sangre periférica tomada en tubos con estabilizador de células; orina; líquido cefalorraquídeo

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Centrífuga refrigerada con rotor de tubos; kits y equipo de extracción de ADN libre circulante; fluorómetro y equipo de electroforesis capilar para el perfil de fragmentos; equipo de PCR digital en gotas o en chips; secuenciador masivo; software de análisis con corrección por identificadores moleculares.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Tubos de sangre con estabilizador de células; kits de extracción de ADN libre circulante; ensayos de PCR digital para las mutaciones de interés; paneles de secuenciación para biopsia líquida con identificadores moleculares; materiales de referencia de ADN libre circulante con variantes a frecuencias conocidas.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos de baja adsorción; puntas; cartuchos y gotas de PCR digital; celdas de flujo.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Tubos especiales; kits; cartuchos; celdas de flujo; controles.

Unidad

% · % de frecuencia alélica de la variante · copias mutadas por mL de plasma · ng de ADN libre por mL de plasma

Rango de referencia

ADN libre total de 5 a 50 ng por mL de plasma; las variantes tumorales circulan típicamente a frecuencias alélicas de 0,1 a 10 %; en enfermedad mínima residual, por debajo de 0,1 %

Norma que lo exige

Las guías de tratamiento oncológico y las obras sociales, que aceptan la biopsia líquida para las mutaciones de resistencia del cáncer de pulmón y cuando el tejido no es accesible; Ley 26.529 de derechos del paciente; los reactivos y las plataformas requieren registro ante la ANMAT cuando se usan para diagnósticoargentina e internacional

Norma que describe la técnica

La revisión de la Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón sobre biopsia líquida (Rolfo y colaboradores, 2021); la guía de la Sociedad Americana de Oncología Clínica y el Colegio Americano de Patólogos sobre ADN tumoral circulante (Merker y colaboradores, 2018); las recomendaciones de la ESMO; ISO 20186-3 para la preanalítica de ADN libre circulante en plasma; ISO 15189argentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

ISO 20186-3:2019; guía ASCO/CAP (2018)

Volumen de muestra

Dos tubos de 10 mL de sangre en tubos con estabilizador, que rinden 6 a 8 mL de plasma; más un tubo con EDTA para la capa leucocitaria si se secuencia

Conservación y transporte

La preanalítica lo es todo: la sangre en tubos con EDTA comunes se procesa dentro de las 2 a 4 horas, y en tubos con estabilizador puede esperar hasta varios días a temperatura ambiente sin agitar ni refrigerar. Un plasma con hemólisis o con células arrastradas está inundado de ADN de leucocitos y la fracción tumoral se diluye por debajo de la detección. El plasma se congela a -80 grados en alícuotas y no se descongela más de una vez. Se registra el momento de la toma respecto del tratamiento, porque la carga de ADN tumoral cambia en días.

Límite de detección típico

0,01 a 0,1 % de frecuencia alélica por PCR digital; 0,1 a 0,5 % por secuenciación con identificadores moleculares

Incertidumbre típica

±20 a 30 % relativo en la frecuencia alélica a niveles bajos; el falso negativo por baja liberación de ADN tumoral es la limitación principal

Área

Biología molecular; Clínico/bioquímico; Farmacéutico

Fecha de última actualización: 9/9/2026