Determinación de proteína intacta por espectrometría de masas de alta resolución

Fundamento

La proteína entera se desala en línea y se inyecta en el espectrómetro de alta resolución: el espectro de cargas múltiples se deconvoluciona y da la masa de la molécula completa, que se compara con la teórica y con la del producto de referencia.

Analito (qué se busca)

Proteína intacta

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión y proteínas recombinantes; conjugados anticuerpo-fármaco; biosimilares en comparabilidad; graneles y productos terminados biotecnológicos

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Espectrómetro de masas de alta resolución con fuente de electrospray y rango de masa extendido; cromatógrafo líquido con columna de poro ancho o de exclusión molecular para el desalado en línea, con horno de alta temperatura; programa de deconvolución de espectros.

Proveedores de Estufas, muflas y hornos · Cromatografía líquida (HPLC/UPLC) · Espectrometría de masas.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Solventes y aditivos volátiles de grado espectrometría de masas; patrones de calibración de masa en el rango de trabajo; producto de referencia.

Proveedores de Reactivos y solventes · Metrología y calibración · Espectrometría de masas.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de poro ancho dedicadas a proteínas intactas; viales de bajo enlace de proteínas; filtros de centrífuga para el intercambio de buffer cuando la formulación no es compatible.

Proveedores de Reactivos y solventes · Centrífugas.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Columnas; solventes de alta pureza; patrones de calibración; enzimas.

Proveedores de Reactivos y solventes · Metrología y calibración.

Unidad

kg · masa molecular intacta observada y teórica (Da y kDa) · desviación entre ambas (ppm o Da) · masa de las cadenas pesada y liviana y de los fragmentos de bisagra · glicoformas asignadas y su abundancia relativa (%) · diferencia de masa entre las formas reducida y no reducida como verificación de los puentes disulfuro · relación fármaco-anticuerpo y su distribución en conjugados

Rango de referencia

La diferencia con la masa teórica se informa en partes por millón o en daltons; las glicoformas se identifican por su separación característica

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre registro de medicamentos biológicos y biosimilares, que exigen la determinación de la masa molecular como parte de la caracterización fisicoquímica; los protocolos de comparabilidad ante cambios de proceso; los requisitos de los mercados de exportación; las normas de acreditación del laboratorionorma internacional

Norma que describe la técnica

La guía ICH Q6B, que incluye la masa molecular entre las propiedades fisicoquímicas a determinar; ICH Q5E sobre comparabilidad; el método general de espectrometría de masas de las farmacopeas y los capítulos sobre caracterización de proteínas terapéuticas y sobre anticuerpos monoclonales; los procedimientos validados del laboratorio para la deconvolución y la asignación de glicoformasnorma internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B; ICH Q5E; capítulos de caracterización de proteínas de las farmacopeas vigentes

Volumen de muestra

De 10 a 50 µg de proteína por determinación

Conservación y transporte

La muestra se conserva según su especificación y, si la formulación tiene tensioactivos o sales no volátiles, se intercambia el buffer antes de inyectar, porque suprimen la ionización y arruinan el espectro.

Límite de detección típico

Se resuelven diferencias de masa de unos pocos daltons sobre proteínas de más de cien kilodaltons

Incertidumbre típica

De 10 a 50 ppm sobre proteínas intactas, mejor sobre subunidades

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 1/10/2026

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