Determinación de subunidades por espectrometría de masas de alta resolución

Fundamento

La molécula se corta en piezas controladas —reduciendo los puentes disulfuro o digiriendo la región bisagra con una proteasa específica— y se mide la masa de cada subunidad. Así se ubica dónde está la diferencia cuando la masa intacta no coincide.

Analito (qué se busca)

Subunidades

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión y proteínas recombinantes; conjugados anticuerpo-fármaco; biosimilares en comparabilidad; graneles y productos terminados biotecnológicos

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Espectrómetro de masas de alta resolución con fuente de electrospray y rango de masa extendido; cromatógrafo líquido con columna de poro ancho o de exclusión molecular para el desalado en línea, con horno de alta temperatura; programa de deconvolución de espectros.

Proveedores de Estufas, muflas y hornos · Cromatografía líquida (HPLC/UPLC) · Espectrometría de masas.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Agente reductor; proteasa específica de la región bisagra; solventes y aditivos volátiles de grado espectrometría; patrones de calibración; producto de referencia.

Proveedores de Reactivos y solventes · Metrología y calibración.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de poro ancho dedicadas a proteínas intactas; viales de bajo enlace de proteínas; filtros de centrífuga para el intercambio de buffer cuando la formulación no es compatible.

Proveedores de Reactivos y solventes · Centrífugas.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Columnas; solventes de alta pureza; patrones de calibración; enzimas.

Proveedores de Reactivos y solventes · Metrología y calibración.

Unidad

kg · masa molecular intacta observada y teórica (Da y kDa) · desviación entre ambas (ppm o Da) · masa de las cadenas pesada y liviana y de los fragmentos de bisagra · glicoformas asignadas y su abundancia relativa (%) · diferencia de masa entre las formas reducida y no reducida como verificación de los puentes disulfuro · relación fármaco-anticuerpo y su distribución en conjugados

Rango de referencia

Se informa la masa de cada subunidad frente a la teórica; en conjugados anticuerpo-fármaco da además la distribución de la carga de droga

Norma que lo exige

Las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre registro de medicamentos biológicos y biosimilares, que exigen la determinación de la masa molecular como parte de la caracterización fisicoquímica; los protocolos de comparabilidad ante cambios de proceso; los requisitos de los mercados de exportación; las normas de acreditación del laboratorionorma internacional

Norma que describe la técnica

La guía ICH Q6B, que incluye la masa molecular entre las propiedades fisicoquímicas a determinar; ICH Q5E sobre comparabilidad; el método general de espectrometría de masas de las farmacopeas y los capítulos sobre caracterización de proteínas terapéuticas y sobre anticuerpos monoclonales; los procedimientos validados del laboratorio para la deconvolución y la asignación de glicoformasnorma internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B; ICH Q5E; capítulos de caracterización de proteínas de las farmacopeas vigentes

Volumen de muestra

De 10 a 50 µg de proteína por determinación

Conservación y transporte

La muestra se conserva según su especificación y, si la formulación tiene tensioactivos o sales no volátiles, se intercambia el buffer antes de inyectar, porque suprimen la ionización y arruinan el espectro.

Límite de detección típico

Se resuelven diferencias de masa de unos pocos daltons sobre proteínas de más de cien kilodaltons

Incertidumbre típica

De 10 a 50 ppm sobre proteínas intactas, mejor sobre subunidades

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 1/10/2026

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