Metabarcoding de hongos por secuenciación de amplicones del espaciador transcripto interno (ITS)

Fundamento

Se extrae el ADN total de la muestra con lisis mecánica, porque las paredes de los hongos son resistentes, y se amplifica por PCR la región ITS del ADN ribosomal, en general el ITS1 o el ITS2, que está entre los genes de ARN ribosomal conservados y varía lo suficiente entre especies como para distinguirlas, con cebadores diseñados para cubrir la mayor cantidad de grupos de hongos y excluir plantas. Los amplicones, con índices que identifican cada muestra, se secuencian juntos en un equipo de lecturas cortas o largas; las lecturas se filtran por calidad, se eliminan las quimeras, se agrupan en variantes de secuencia exactas y se asignan taxonómicamente comparándolas con la base de datos UNITE de secuencias de ITS curadas, que da género y muchas veces especie. Se obtienen la lista de taxones con su abundancia relativa de lecturas, los índices de diversidad y las diferencias entre muestras, y los taxones se anotan por su ecología (saprótrofos, micorrízicos, patógenos) con bases como FUNGuild. Las abundancias son relativas y sesgadas por el número de copias de ITS, que varía mucho entre especies, así que las comparaciones válidas son entre muestras del mismo estudio. Se acompaña de controles negativos de extracción y de PCR y de una comunidad sintética de hongos como control positivo.

Matriz (en qué muestra)

Suelo; raíces y hojas; compost; granos y alimentos; aire de interiores; madera; agua; materia fecal; muestras clínicas

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Homogeneizador de perlas y extractor de ADN; termociclador; fluorómetro; equipo de electroforesis capilar; secuenciador masivo; servidor y software de análisis de amplicones (DADA2, QIIME 2) con la base UNITE.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Kits de extracción de ADN de suelo y muestras complejas; cebadores de ITS (por ejemplo ITS1F e ITS2, o ITS3 e ITS4) con adaptadores; polimerasa de alta fidelidad; kits de indexado y de secuenciación; comunidad sintética de hongos de control.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos con perlas; tubos y puntas libres de nucleasas; placas; celdas de flujo.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Kits; cebadores; celdas de flujo; controles.

Unidad

% · abundancia relativa de lecturas por taxón · número de variantes de secuencia · índices de diversidad de Shannon y de Simpson

Rango de referencia

Un suelo agrícola tiene de cientos a miles de variantes de secuencia de hongos, dominado por ascomicetos saprótrofos; la profundidad usual es de 20.000 a 100.000 lecturas por muestra

Norma que lo exige

No hay una norma argentina que lo exija; lo piden los proyectos de investigación del INTA, el CONICET y las universidades, los registros de inoculantes micorrízicos y de bioinsumos ante el SENASA para demostrar la colonización, los estudios de calidad biológica de suelos y los peritajes por humedad y mohos en edificiosnorma argentina

Norma que describe la técnica

Schoch y colaboradores (2012), que establecieron el ITS como código de barras universal de los hongos; los protocolos del Earth Microbiome Project para amplicones de ITS; la base de datos UNITE para la asignación taxonómica; los estándares MIxS y MIMARKS del Consorcio de Estándares Genómicos; las recomendaciones de Nilsson y colaboradores (2019) sobre buenas prácticas en metabarcoding de hongosnorma argentina

Edición y vigencia de la norma

UNITE versión 10 (2024); MIxS versión 6 (2022)

Volumen de muestra

0,25 a 0,5 g de suelo o compost; 50 a 100 mg de raíces lavadas; 1 g de alimento; filtros de aire o hisopos de superficies; 1 a 10 ng de ADN por PCR

Conservación y transporte

Las muestras se congelan o se conservan en estabilizador de ADN en el momento de la toma, sobre todo las raíces y los alimentos, donde los hongos de crecimiento rápido colonizan en horas. Las raíces se lavan para separar el suelo adherido si se quiere la comunidad de la raíz y no la del suelo. El ITS1 y el ITS2 dan comunidades algo distintas y los cebadores tienen sesgos conocidos contra algunos grupos (por ejemplo los micorrízicos arbusculares, que se estudian mejor con cebadores de 18S); el informe tiene que decir qué región y qué cebadores se usaron. Los blancos de extracción y de PCR van en cada corrida.

Límite de detección típico

Taxones con abundancia relativa de 0,01 a 0,1 % con 50.000 lecturas por muestra

Incertidumbre típica

Las abundancias relativas tienen sesgos de copias de ITS y de cebadores; la riqueza depende de la profundidad y se compara a profundidad igualada

Área

Biología molecular; Microbiología; Agronomía

Fecha de última actualización: 9/9/2026