Metagenómica shotgun: secuenciación del ADN total de una comunidad microbiana

Fundamento

Se extrae el ADN total de la muestra con protocolos que rompen por igual a las bacterias grampositivas, las esporas y los hongos, en general con lisis mecánica con perlas, porque una extracción sesgada da una comunidad falsa. El ADN se fragmenta, se ligan adaptadores y se secuencia sin ninguna amplificación dirigida, con lecturas cortas a una profundidad de decenas de millones de lecturas por muestra o con lecturas largas que facilitan el ensamblado. Las lecturas se clasifican taxonómicamente comparándolas con bases de datos de genomas, por marcadores o por k-meros, y se obtienen las abundancias relativas de cada especie; se anotan funcionalmente contra bases de genes y rutas metabólicas, y contra bases de genes de resistencia y de virulencia. Con suficiente profundidad se ensamblan los contigs y se agrupan por composición y cobertura en genomas ensamblados a partir del metagenoma, que permiten describir organismos que nunca se cultivaron, como la mayoría de los de un digestor anaerobio. Los controles negativos de extracción y los controles positivos de comunidad sintética de composición conocida cuantifican la contaminación y el sesgo. Los resultados son relativos, no absolutos, salvo que se agregue un patrón interno o se combinen con recuentos por PCR cuantitativa. En diagnóstico clínico, la metagenómica sobre líquido cefalorraquídeo o sangre identifica patógenos sin hipótesis previa.

Matriz (en qué muestra)

Suelo; agua; barros de digestores y de plantas de tratamiento; materia fecal e intestino; alimentos fermentados; superficies; aire; muestras clínicas

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Homogeneizador de perlas y extractor de ADN; fluorómetro; equipo de preparación de bibliotecas; secuenciador masivo de lecturas cortas de alto rendimiento o de lecturas largas; servidor de cómputo de alta capacidad y software de clasificación, ensamblado y anotación.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Kits de extracción de ADN de muestras complejas con lisis mecánica; kits de preparación de bibliotecas; reactivos de secuenciación; comunidades microbianas sintéticas de referencia como controles positivos; bases de datos de genomas, genes y rutas actualizadas.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos con perlas; tubos y puntas libres de nucleasas; celdas de flujo; recipientes estériles de muestreo; estabilizador de ADN para muestras de campo.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Kits; celdas de flujo; controles; estabilizador.

Unidad

% · abundancia relativa por taxón · lecturas por millón por gen · número de genomas ensamblados · índices de diversidad

Rango de referencia

Profundidad de 10 a 50 millones de lecturas por muestra para perfiles de comunidad y de 100 millones o más para ensamblar genomas de organismos minoritarios; un digestor anaerobio tiene cientos de especies, dominadas por unas pocas decenas

Norma que lo exige

No hay una norma argentina que exija metagenómica; la piden los proyectos de investigación de la Agencia I+D+i, el CONICET y el INTA, los estudios de vigilancia de resistencia a antimicrobianos del plan nacional de resistencia y de la OMS, y las empresas de biogás, de fermentación y de bioinsumos para caracterizar sus procesos; los datos humanos están protegidos por la Ley 25.326argentina e internacional

Norma que describe la técnica

Los estándares MIxS y MIMS del Consorcio de Estándares Genómicos para la descripción de metagenomas; los protocolos del Earth Microbiome Project y del Proyecto del Microbioma Humano; las recomendaciones del consorcio de control de calidad de microbiomas (MBQC) y del Estándar Internacional de Microbiomas (IMS); ISO 20397; las guías de la Sociedad Americana de Microbiología para la metagenómica clínicaargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

MIxS versión 6 (2022); ISO 20397-1:2022

Volumen de muestra

0,25 a 1 g de suelo o barro; 100 a 1.000 mL de agua filtrados en membrana de 0,22 micrones; 0,2 g de materia fecal; al menos 1 a 10 ng de ADN, idealmente 100 ng o más

Conservación y transporte

La comunidad cambia apenas se toma la muestra: se congela a -80 grados en el momento o se conserva en estabilizador de ADN, y nunca se deja a temperatura ambiente horas, porque las bacterias de crecimiento rápido se multiplican y las anaerobias mueren. Se registran los metadatos con el detalle de los estándares (lugar, fecha, profundidad, temperatura, pH, tratamiento). Los blancos de extracción son obligatorios en muestras de baja biomasa, donde los reactivos aportan más ADN que la muestra. El método de extracción se mantiene fijo dentro de un estudio; cambiarlo cambia la comunidad que se ve.

Límite de detección típico

Especies con abundancia relativa de 0,01 a 0,1 % según la profundidad; los genes de resistencia se detectan desde unas pocas lecturas con verificación

Incertidumbre típica

Las abundancias relativas tienen sesgos de extracción y de base de datos de decenas de por ciento; las comparaciones válidas son dentro de un mismo protocolo

Área

Biología molecular; Microbiología; Ambiental

Fecha de última actualización: 9/9/2026