Modificaciones postraduccionales por digestión enzimática y cromatografía líquida acoplada a masas

Fundamento

La proteína se reduce, se alquila y se digiere con tripsina en condiciones controladas; los péptidos resultantes se separan por cromatografía líquida y se identifican por masa exacta y fragmentación. La digestión es el paso crítico y se valida: si es demasiado enérgica, introduce las mismas modificaciones que el ensayo busca encontrar.

Analito (qué se busca)

Modificaciones postraduccionales

Matriz (en qué muestra)

Anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes: insulinas, eritropoyetina, hormonas y enzimas; biosimilares en desarrollo y en comparabilidad; graneles y productos terminados biotecnológicos; muestras de estudios de estabilidad

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo líquido de ultra alta presión con detector ultravioleta y control fino de temperatura de columna; espectrómetro de masas de alta resolución con capacidad de fragmentación; termobloque para las digestiones; programas de asignación de péptidos.

Proveedores de Cromatografía líquida (HPLC/UPLC) · Espectrometría de masas.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Proteasas de grado secuenciación; reactivos de reducción y alquilación; buffers de digestión; solventes de grado espectrometría; patrones de calibración de masa; producto de referencia.

Proveedores de Reactivos y solventes · Metrología y calibración.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Columnas de fase reversa de partícula pequeña dedicadas a péptidos; viales y placas de bajo enlace de proteínas; filtros de centrífuga para el intercambio de buffer; puntas de baja retención.

Proveedores de Reactivos y solventes · Micropipetas y puntas · Centrífugas.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Columnas; enzimas; solventes de alta pureza; viales.

Proveedores de Reactivos y solventes.

Unidad

1 · % de cobertura de secuencia observada · % de deamidación, de oxidación y de glicación en cada sitio · % de variantes del extremo carboxilo y de ciclación del extremo amino · % de ocupación de los sitios de glicosilación · coincidencia de tiempos de retención y de masas con el producto de referencia · masa exacta de cada péptido (Da)

Rango de referencia

Se informan como porcentaje del péptido modificado sobre el total de ese péptido; cada sitio tiene su criterio

Norma que lo exige

La ley de medicamentos y las disposiciones de la autoridad regulatoria sobre el registro de medicamentos biológicos y biosimilares, que exigen la caracterización fisicoquímica completa y los estudios de comparabilidad con el producto de referencia; las especificaciones de liberación y de estabilidad aprobadas en el registro; las exigencias de los mercados de exportación; las normas de acreditación y las buenas prácticas de laboratorio de controlnorma internacional

Norma que describe la técnica

La guía ICH Q6B sobre especificaciones y procedimientos analíticos para productos biotecnológicos; ICH Q5E sobre comparabilidad ante cambios en el proceso; el capítulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos sobre identificación de péptidos y proteínas por mapeo de péptidos; el método general de la Farmacopea Europea sobre mapa de péptidos; el capítulo sobre anticuerpos monoclonales; ICH Q2 para la validación del métodonorma internacional

Edición y vigencia de la norma

ICH Q6B; ICH Q5E; ICH Q2(R2); métodos generales de mapa de péptidos de las farmacopeas vigentes

Volumen de muestra

De 50 a 200 µg de proteína por digestión

Conservación y transporte

La muestra se conserva a la temperatura de su especificación y se evita congelar y descongelar repetidamente, que induce agregación. Los digeridos se analizan el mismo día o se congelan, porque la deamidación sigue avanzando en el vial del automuestreador.

Límite de detección típico

Las modificaciones se cuantifican desde alrededor del 0,1 al 0,5 % del sitio, según el péptido

Incertidumbre típica

Del 5 al 20 % relativo sobre el nivel de cada modificación, mayor en los niveles bajos

Área

Farmacéutico; Biología molecular; Química analítica

Fecha de última actualización: 1/10/2026

Ficha N.º 4008 · ¿Ves algo para corregir? Escribinos