Secuenciación de ARN (RNA-seq) para perfiles de expresión génica y detección de fusiones

Fundamento

Se extrae ARN total de la muestra y se verifica su integridad, porque el ARN degradado sesga la cobertura; se enriquece el ARN mensajero seleccionando las colas de poliA o se elimina el ARN ribosomal, que es el 90 % del total. El ARN se fragmenta, se retrotranscribe a ADN complementario con cebadores al azar, se sintetiza la segunda hebra conservando la información de la hebra de origen, se ligan adaptadores con índices para poder mezclar decenas de muestras y se amplifica la biblioteca, que se cuantifica y se secuencia en un equipo de lecturas cortas a una profundidad de 20 a 50 millones de lecturas por muestra para expresión y más para isoformas y fusiones. Las lecturas se alinean contra el genoma de referencia o contra el transcriptoma, se cuentan por gen y por isoforma y se normalizan por la profundidad y el largo de los genes; la expresión diferencial entre condiciones se calcula con modelos estadísticos que tienen en cuenta la variabilidad biológica entre réplicas, con al menos tres réplicas por grupo. Las lecturas que unen exones de dos genes distintos revelan las fusiones; las variantes en las lecturas, la expresión alélica. La secuenciación de lecturas largas resuelve las isoformas completas, y la de células individuales, la heterogeneidad de los tejidos. Los resultados se interpretan con análisis de enriquecimiento de vías y se validan por PCR en tiempo real para los genes clave.

Matriz (en qué muestra)

ARN de tejidos, cultivos celulares, sangre, tumores, plantas, microorganismos y muestras ambientales

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Extractor de ARN y equipo de electroforesis capilar para la integridad; termociclador; fluorómetro; equipo de preparación automatizada de bibliotecas; secuenciador masivo de lecturas cortas y, según el caso, de lecturas largas; servidor de cómputo y software de alineamiento, cuantificación y expresión diferencial.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Kits de extracción de ARN con eliminación de ADN; kits de preparación de bibliotecas de ARN con selección de poliA o depleción de ribosomal y conservación de hebra; adaptadores indexados; reactivos de secuenciación; controles de ARN sintético (ERCC) para verificar la cuantificación.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos y puntas libres de nucleasas; placas; celdas de flujo; estabilizador de ARN para el transporte de tejidos.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Kits; celdas de flujo; controles; estabilizador.

Unidad

1 · lecturas por millón por kilobase (TPM, FPKM) · logaritmo del cambio de expresión entre condiciones · valor p ajustado · lecturas de soporte de una fusión

Rango de referencia

Profundidad de 20 a 50 millones de lecturas por muestra para expresión diferencial; número de integridad del ARN mayor a 7 para tejidos frescos; al menos tres réplicas biológicas por condición; cambios de expresión de dos veces con valor p ajustado menor a 0,05 como umbral usual

Norma que lo exige

Las guías oncológicas que aceptan la secuenciación de ARN para la detección de fusiones accionables (NTRK, ALK, ROS1, RET); los proyectos de investigación financiados por la Agencia I+D+i, el CONICET y las universidades, que exigen depósito de los datos en repositorios públicos; Ley 25.326 de protección de datos personales para los datos genómicos humanos; los reactivos de diagnóstico requieren registro ante la ANMATargentina e internacional

Norma que describe la técnica

Las guías y estándares del consorcio ENCODE para experimentos de RNA-seq; las recomendaciones del consorcio de control de calidad de secuenciación (SEQC/MAQC-III); la guía de la Asociación para la Patología Molecular sobre la validación de la secuenciación de ARN para fusiones en oncología; los estándares MINSEQE para el reporte de experimentos de secuenciación; ISO 20397 para la secuenciación masivaargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

Estándares ENCODE para RNA-seq (2020); ISO 20397-1:2022

Volumen de muestra

10 a 50 mg de tejido en estabilizador de ARN o congelado en nitrógeno líquido; 1 a 5 millones de células; 2,5 mL de sangre en tubos con estabilizador de ARN; 100 ng a 1 µg de ARN total por biblioteca

Conservación y transporte

El ARN se degrada en minutos en un tejido a temperatura ambiente: la muestra se congela en nitrógeno líquido o se sumerge en estabilizador apenas se toma, y se transporta congelada. La sangre se toma en tubos con estabilizador de ARN, porque el perfil de expresión de los leucocitos cambia en horas. Los tejidos en parafina dan ARN fragmentado que exige protocolos de depleción de ribosomal y más profundidad, y sirven para fusiones pero con limitaciones para expresión. El diseño experimental, con réplicas y controles de lote, se decide antes de extraer: no hay bioinformática que arregle un experimento sin réplicas.

Límite de detección típico

Genes con unas pocas decenas de lecturas se cuantifican; las fusiones se llaman con al menos 3 a 5 lecturas de soporte

Incertidumbre típica

Coeficiente de variación de 10 a 20 % entre réplicas técnicas para genes de expresión media; mayor para genes de baja expresión

Área

Biología molecular; Clínico/bioquímico; Agronomía

Fecha de última actualización: 9/9/2026