Secuenciación de Sanger (terminación de cadena)

Fundamento

Se hace una PCR con didesoxinucleótidos marcados con cuatro fluoróforos que detienen la extensión al azar; los fragmentos resultantes, de todos los largos posibles, se separan por electroforesis capilar y el orden de colores revela la secuencia.

Analito (qué se busca)

Secuencia de bases

Matriz (en qué muestra)

Producto de PCR / plásmido

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Secuenciador de electroforesis capilar; termociclador; centrífuga de placas.

Proveedores de Centrífugas · Biología molecular.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Mezcla de secuenciación con ddNTPs marcados; buffer; polímero de separación; formamida; estándar de tamaño.

Proveedores de Reactivos y solventes.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Placas de 96 pocillos; columnas de purificación.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Capilares; polímero; septas.

Unidad

m · pb leídas · Valor de calidad Phred (Q)

Rango de referencia

Lecturas útiles de 500-900 pb; Q20 como umbral

Edición y vigencia de la norma

Esta técnica no responde a una norma única: se aplica con procedimientos internos validados por cada laboratorio, o forma parte de un método más amplio que sí tiene norma. Si el resultado va a usarse con fines regulatorios o legales, hay que acordar de antemano el procedimiento y su validación.

Volumen de muestra

5 a 20 ng de producto de PCR purificado, o 200 a 500 ng de plásmido

Conservación y transporte

Tubo a 4 °C por días o a −20 °C. El producto se purifica antes: los cebadores y nucleótidos sobrantes arruinan la lectura.

Límite de detección típico

Lee de 500 a 900 bases de corrido con buena calidad

Incertidumbre típica

Menos de 1 error cada 1.000 bases en la zona de buena calidad

Área

Biología molecular

Fecha de última actualización: 3/9/2026

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