ADN de levaduras por secuenciación de amplicones del espaciador transcripto interno (ITS)

Fundamento

Se extrae el ADN total de la muestra, se amplifica la región ITS con cebadores universales de hongos y se secuencian los amplicones; después el análisis agrupa las secuencias y las asigna contra una base de referencia. Lo que se informa son abundancias relativas y no recuentos: el método dice qué proporción de las lecturas corresponde a cada hongo, no cuántos hay. Las levaduras salen de la misma corrida: el ITS las cubre igual que al resto de los hongos, y lo que las separa es la asignación taxonómica y no un ensayo distinto.

Analito (qué se busca)

ADN de levaduras

Matriz (en qué muestra)

Suelo; raíces y hojas; compost; granos y alimentos; aire de interiores; madera; agua; materia fecal; muestras clínicas

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Homogeneizador de perlas y extractor de ADN; termociclador; fluorómetro; equipo de electroforesis capilar; secuenciador masivo; servidor y programas de análisis de amplicones con la base UNITE.

Proveedores de Baños, agitación y homogeneización · Biología molecular.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Kits de extracción de ADN; cebadores de ITS con adaptadores; polimerasa de alta fidelidad; kits de indexado y de secuenciación; controles.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Tubos con perlas; tubos y puntas libres de nucleasas; placas; celdas de flujo; comunidad sintética de control en cada corrida.

Proveedores de Micropipetas y puntas.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Kits; cebadores; celdas de flujo; controles.

Unidad

1 · % · abundancia relativa de lecturas por taxón · número de variantes de secuencia · índices de diversidad de Shannon y de Simpson

Rango de referencia

Se informan como parte del perfil fúngico total; la resolución a nivel de especie depende de la base de referencia

Norma que lo exige

No hay una norma argentina que lo exija; lo piden los proyectos de investigación del INTA, el CONICET y las universidades, los registros de inoculantes micorrízicos y de bioinsumos ante el SENASA para demostrar la colonización, los estudios de calidad biológica de suelos y los peritajes por humedad y mohos en edificiosnorma argentina

Norma que describe la técnica

Schoch y colaboradores (2012), que establecieron el ITS como código de barras universal de los hongos; los protocolos del Earth Microbiome Project para amplicones de ITS; la base de datos UNITE para la asignación taxonómica; los estándares MIxS y MIMARKS del Consorcio de Estándares Genómicos; las recomendaciones de Nilsson y colaboradores (2019) sobre buenas prácticas en metabarcoding de hongosnorma argentina

Edición y vigencia de la norma

UNITE versión 10 (2024); MIxS versión 6 (2022)

Volumen de muestra

0,25 a 0,5 g de suelo o compost; 50 a 100 mg de raíces lavadas; 1 g de alimento; filtros de aire o hisopos de superficies; 1 a 10 ng de ADN por PCR

Conservación y transporte

Las muestras se congelan o se conservan en estabilizador de ADN en el momento de la toma, sobre todo las raíces y los alimentos, donde los hongos de crecimiento rápido colonizan en horas. Las raíces se lavan para separar el suelo adherido si se quiere la comunidad de la raíz y no la del suelo. El ITS1 y el ITS2 dan comunidades algo distintas y los cebadores tienen sesgos conocidos contra algunos grupos (por ejemplo los micorrízicos arbusculares, que se estudian mejor con cebadores de 18S); el informe tiene que decir qué región y qué cebadores se usaron. Los blancos de extracción y de PCR van en cada corrida.

Límite de detección típico

Taxones con abundancia relativa de 0,01 a 0,1 % con 50.000 lecturas por muestra

Incertidumbre típica

Las abundancias relativas tienen sesgos de copias de ITS y de cebadores; la riqueza depende de la profundidad y se compara a profundidad igualada

Área

Biología molecular; Microbiología; Agronomía

Fecha de última actualización: 1/10/2026

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