Detección de Brettanomyces y determinación de fenoles volátiles en vinos

Fundamento

La levadura se detecta por cultivo en medios selectivos con cicloheximida, que inhibe a Saccharomyces y deja crecer a Brettanomyces, incubando de siete a catorce días porque crece muy lento, y por PCR en tiempo real específica de la especie Dekkera bruxellensis, que da resultado en horas y detecta también las células viables pero no cultivables, que son la mayoría en un vino sulfitado. La citometría de flujo con marcadores de viabilidad y sondas específicas es otra vía rápida. El marcador químico del defecto son los fenoles volátiles: la levadura transforma los ácidos hidroxicinámicos del vino en 4-vinilfenol y 4-vinilguayacol y luego en 4-etilfenol y 4-etilguayacol, que son los que dan el olor. Se determinan por microextracción en fase sólida del espacio de cabeza o por extracción líquido-líquido y cromatografía gaseosa con espectrometría de masas o con detector de ionización de llama, con patrón interno, en concentraciones de microgramos por litro. El umbral de percepción del 4-etilfenol está alrededor de 400 microgramos por litro en tinto, y la relación entre etilfenol y etilguayacol, cercana a diez a uno, confirma que el origen es Brettanomyces. Se completa con el control de los precursores y con el análisis de las superficies y las barricas por hisopado y cultivo.

Analito (qué se mide)

Brettanomyces, fenoles volátiles (4-etilfenol y 4-etilguayacol) y bacterias alterantes

Matriz (en qué muestra)

Vino tinto en crianza y en botella; barricas; superficies de bodega; borras

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Cromatógrafo gaseoso con espectrómetro de masas y sistema de microextracción en fase sólida; termociclador de PCR en tiempo real; estufa de cultivo y cabina de siembra; microscopio; citómetro de flujo opcional.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Medios selectivos con cicloheximida; kits de extracción de ADN y de PCR específica de Dekkera bruxellensis; patrones de 4-etilfenol, 4-etilguayacol y sus deuterados; fibras de microextracción; cloruro de sodio.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Placas y tubos de cultivo; membranas de filtración; viales de espacio de cabeza; hisopos para superficies.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Medios; kits; patrones; fibras; viales.

Unidad

kg/m3 · µg/L de 4-etilfenol y 4-etilguayacol · unidades formadoras de colonias por mL · copias de genoma por mL

Rango de referencia

Umbral de percepción del 4-etilfenol de 400 µg/L en tintos, con rechazo comercial habitual por encima de 600 a 1.000 µg/L; una población de 100 células por mL de Brettanomyces ya es riesgo

Norma que lo exige

Las especificaciones de calidad de los compradores internacionales y de las cadenas, que rechazan partidas por encima de umbrales de 4-etilfenol; los protocolos de calidad de las bodegas y de las certificaciones de origen; el Código Alimentario Argentino y las resoluciones del INV en cuanto a genuinidad y aptitud del productoargentina e internacional

Norma que describe la técnica

Los métodos de la OIV sobre determinación de fenoles volátiles y sobre microorganismos alterantes; los métodos publicados por el Australian Wine Research Institute para 4-etilfenol y 4-etilguayacol por microextracción en fase sólida y cromatografía; los protocolos de PCR específica de Dekkera bruxellensis validados en la literatura enológicaargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

Compendio OIV, edición 2024; métodos AWRI vigentes

Volumen de muestra

100 mL de vino para el análisis químico y 250 mL a 1 litro para la filtración y el cultivo; hisopados de barricas y superficies

Conservación y transporte

La muestra se toma con material estéril y se procesa rápido, refrigerada; para el cultivo no se filtra ni se sulfita antes. El seguimiento tiene que ser periódico y por barrica o por lote, porque la contaminación es focal: una barrica infectada contamina el corte entero al mezclar. Los hisopados de barricas se toman del interior de las duelas y de la zona de la boca, que es donde la levadura sobrevive. La determinación química y la microbiológica se interpretan juntas: cero fenoles con levadura presente significa que el problema todavía se puede evitar.

Límite de detección típico

1 a 5 µg/L de fenoles volátiles; 1 célula por mL por PCR con preconcentración

Incertidumbre típica

±10 % relativo en fenoles volátiles; los recuentos microbiológicos tienen la variabilidad propia del cultivo

Área

Alimentos y bebidas; Microbiología; Biología molecular

Fecha de última actualización: 9/9/2026