Coloración de Gram y pruebas bioquímicas para diferenciar enterobacterias

Fundamento

La coloración de Gram es la primera decisión de cualquier identificación bacteriana y descansa en una diferencia estructural real: la pared de las bacterias grampositivas, gruesa y rica en peptidoglicano, retiene el complejo de cristal violeta y yodo frente al decolorante, mientras que la de las gramnegativas, delgada y cubierta por una membrana externa lipídica, lo pierde y toma el colorante de contraste. La variante de Hucker ajusta las concentraciones y los tiempos para mejorar la nitidez. El paso crítico es la decoloración: unos segundos de más convierten a una grampositiva en gramnegativa, y por eso se incluye siempre un control con cepas de ambos tipos en el mismo portaobjetos o en paralelo. La observación informa además la morfología —cocos, bacilos, formas curvas— y la disposición, que orientan el paso siguiente. Las pruebas bioquímicas diferencian dentro de las enterobacterias aprovechando su distinto equipamiento enzimático: fermentación de azúcares con o sin producción de gas, producción de sulfuro de hidrógeno, hidrólisis de urea, descarboxilación de aminoácidos, utilización de citrato, producción de indol, movilidad. La combinación de resultados define un perfil que se compara con tablas de identificación o con sistemas comerciales miniaturizados, y permite llegar al género y en muchos casos a la especie.

Matriz (en qué muestra)

Aislamientos de productos de la industria pesquera; colonias de medios selectivos y no selectivos; enterobacterias aisladas de pescado, moluscos y crustáceos; cepas de control de calidad de medios

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

Microscopio óptico con objetivo de inmersión; cabina de seguridad biológica; estufas de cultivo a distintas temperaturas; autoclave; mechero o incinerador de asas; sistemas miniaturizados de identificación bioquímica; lupa.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Cristal violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina o fucsina; medios diferenciales de fermentación, urea, citrato, sulfuro-indol-movilidad y descarboxilasas; reactivos de revelado; cepas de referencia grampositiva y gramnegativa.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Portaobjetos y aceite de inmersión; tubos y placas estériles; asas y ansas; planillas de perfiles bioquímicos; identificación del aislamiento, de la muestra de origen y del medio de aislamiento.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Colorantes y medios; portaobjetos; material estéril descartable.

Unidad

Ninguna · resultado de la coloración: grampositivo o gramnegativo, con morfología y disposición · perfil de resultados de cada prueba bioquímica · identificación alcanzada: género o especie · resultado de las cepas de control incluidas en la serie · medio y condiciones del aislamiento de origen

Rango de referencia

La decoloración de la coloración de Gram es el paso que más falsos resultados produce, y por eso se procesan siempre controles de ambos tipos en la misma serie: sin ellos, una decoloración excesiva convierte a todas las bacterias en gramnegativas y la identificación arranca por el camino equivocado

Norma que lo exige

El Código Alimentario Argentino y los criterios microbiológicos de productos pesqueros, que exigen identificar los microorganismos indicadores y patógenos; los protocolos de habilitación de plantas y de exportación; los requisitos de acreditación del laboratorio de microbiología de alimentos; las investigaciones de brotes de enfermedades transmitidas por alimentosnorma argentina

Norma que describe la técnica

IRAM 15121, que fija los métodos de coloración de bacterias por la técnica de Gram-Hucker en productos de la industria pesquera; IRAM 15122-1, IRAM 15122-2, IRAM 15122-3 e IRAM 15122-4, que fijan las pruebas bioquímicas para diferenciar enterobacterias; IRAM 15113, sobre el método de recuento de enterobacteriasnorma argentina

Edición y vigencia de la norma

IRAM 15121:1989; IRAM 15122-1:1989; IRAM 15122-2:1989; IRAM 15122-3:1989; IRAM 15122-4:1989; IRAM 15113:1989

Volumen de muestra

Destructivo para el aislamiento. Una colonia por identificación

Conservación y transporte

Las pruebas bioquímicas se siembran a partir de un cultivo puro y joven, porque un cultivo mixto da perfiles que no corresponden a ningún microorganismo y uno viejo pierde actividad enzimática y da negativos falsos. Se procesan cepas de referencia en cada serie, dado que los medios diferenciales se degradan y pierden capacidad de discriminación.

Límite de detección típico

No aplica: es una identificación sobre aislamiento

Incertidumbre típica

La identificación es cualitativa; los perfiles se informan con su nivel de confianza cuando se usan sistemas comerciales

Área

Microbiología; Alimentos y bebidas; Clínico/bioquímico

Fecha de última actualización: 11/9/2026