Validación y verificación de métodos microbiológicos alternativos frente a los métodos de referencia

Fundamento

La validación compara el método alternativo con el de referencia sobre un número grande de muestras naturales y artificialmente contaminadas, cubriendo todas las categorías de matriz para las que se quiere el alcance. Para los métodos cualitativos, de presencia o ausencia, se determinan la exactitud relativa, la sensibilidad y la especificidad relativas a partir de la tabla de concordancia entre los dos métodos, y se estima el límite de detección con series de niveles de contaminación bajos, ajustando la fracción de positivos con un modelo que da el nivel al que se detecta el 50 %. Para los métodos cuantitativos se estudian la linealidad, la exactitud relativa mediante la regresión de los recuentos del método alternativo contra el de referencia, la repetibilidad y la reproducibilidad. La inclusividad se evalúa con un panel de cepas objetivo de distinta procedencia, que el método tiene que detectar, y la exclusividad con un panel de cepas no objetivo, incluidas las cercanas taxonómicamente, que no debe detectar. La robustez se estudia variando de manera deliberada las condiciones del método dentro de márgenes razonables. Cuando el método ya está validado por un organismo reconocido, el laboratorio no repite toda la validación sino que hace una verificación en su propio ámbito, con un número menor de muestras de sus matrices, para demostrar que lo aplica correctamente. Todo se documenta con el alcance exacto, que es la combinación de método, analito y categorías de matriz.

Matriz (en qué muestra)

Métodos rápidos y automatizados aplicados a alimentos, agua, productos farmacéuticos y muestras ambientales

Equipamiento necesario¿Dónde lo compro?

El del método alternativo en evaluación y el del método de referencia en paralelo; incubadoras; cabina; contadores; software estadístico para el tratamiento de los datos de validación.

Reactivos¿Dónde lo compro?

Medios y reactivos de los dos métodos; paneles de cepas de inclusividad y de exclusividad de colecciones reconocidas; materiales de referencia certificados y muestras de ensayos de aptitud.

Material de laboratorio¿Dónde lo compro?

Muestras naturales de todas las categorías de matriz del alcance; material de siembra y de dilución.

Consumibles¿Dónde lo compro?

Medios; kits; cepas; muestras.

Unidad

1 · % de exactitud, sensibilidad y especificidad relativas · unidades formadoras de colonias del límite de detección · pendiente y ordenada de la regresión en métodos cuantitativos

Rango de referencia

Un estudio de validación completo usa al menos 60 muestras por categoría de matriz para los métodos cualitativos; la verificación por el usuario, entre 5 y 20 muestras según la norma; los criterios de aceptación se fijan por categoría

Norma que lo exige

ISO/IEC 17025 y los organismos de acreditación, que exigen validar o verificar todo método antes de usarlo y definir el alcance; el Código Alimentario Argentino y las normas oficiales, que aceptan métodos alternativos validados frente a los de referencia; las farmacopeas, que admiten métodos microbiológicos alternativos con validación según sus capítulos; los requisitos de los mercados de exportaciónargentina e internacional

Norma que describe la técnica

ISO 16140-2 para la validación de métodos alternativos frente a un método de referencia e ISO 16140-3 para la verificación por el laboratorio usuario; ISO 16140-1 para el vocabulario; USP <1223> para la validación de métodos microbiológicos alternativos y Farmacopea Europea 5.1.6; ISO 13843 para la validación de métodos en microbiología del agua; los protocolos de organismos de certificación de métodos como AOAC y AFNORargentina e internacional

Edición y vigencia de la norma

ISO 16140-2:2016 con enmienda 2020; ISO 16140-3:2021; USP <1223>, USP-NF 2024

Volumen de muestra

Decenas a cientos de muestras naturales y contaminadas de cada categoría de matriz

Conservación y transporte

El alcance es lo que se valida y nada más: un método validado para carne no está validado para lácteos, y usar el kit fuera de su alcance validado es una no conformidad segura en una auditoría. Las muestras de validación tienen que incluir muestras naturalmente contaminadas y no solo inoculadas, porque el estrés de las células naturales es distinto. Las cepas de los paneles de inclusividad se eligen diversas y de distintos orígenes. Los datos crudos y el informe de validación se conservan y se revisan cuando cambia el kit, el equipo o el proveedor.

Límite de detección típico

El propio límite de detección determinado, en general de 1 a 10 unidades formadoras de colonias en la porción analizada

Incertidumbre típica

Los métodos cualitativos se caracterizan por sensibilidad y especificidad; los cuantitativos por su incertidumbre de medición, del orden de 0,2 a 0,5 unidades logarítmicas

Área

Microbiología; Química analítica; Alimentos y bebidas

Fecha de última actualización: 9/9/2026